新型微血管仪在妊娠大鼠动脉功能下调机制研究中的应用

林 晨 王铭伟 张再重 林 楠 杨为锦 吴伟航 王 瑜

以妊娠高血压综合征为代表的妊娠期疾病是导致孕产妇和围生期胎儿死亡的主要原因之一，血管功能下调在其中扮演重要角色，临近子宫的微小动脉功能改变尤具研究价值[1～3]。目前测量微小动脉舒缩功能的主流方法是用细金属丝挂钩勾住血管环，并通过张力转换器将金属丝传导的牵张力进行换算来表达血管环舒缩变化[3～5]。然而受限于金属丝的口径以及硬度，现有方法对微小动脉舒张与收缩功能的测量仅仅局限于口径大于300μm的微小血管，当靶血管的口径小于300μm，用现有的技术手段很难测量。在本研究中，笔者采用自主研发的新型双针套接式微小动脉舒缩功能测试仪对大鼠微小动脉舒缩功能进行测量，成功测得口径小于300μm的大鼠子宫动脉功能，为妊高症血管功能改变的机制研究提供了更多实验依据。

材料与方法

1.材料:(1)双针套接式微血管功能测量装置：由恒温浴槽、可伸缩软针、固定软针、恒温浴槽进水口、出水口等五部分构成。装置主体为树脂材料，采用3D打印而成，长8cm，宽5cm，高2cm，恒温浴槽长5cm，宽3cm，高2cm，出水口直径0.3cm，固定软针以及可伸缩软针为pet高分子材料制成，主体长度4cm，主体外径0.15cm，尖端长度0.5cm，尖端直径200μm；软针外接输液管道和夹闭器，可经由软针向血管腔内输注液体，夹闭器夹闭后可使血管腔形成闭合腔，其内液体不与外接相交通。(2)实验动物：清洁级12周龄雌性未孕以及妊娠的Sprague-Dawley(SD)大鼠，健康，体质量200±20g，由福州总医院比较医学科提供。传统610 M 型多通道血管张力测定仪(含2根直径80μm的不锈钢丝挂钩，丹麦DMT 公司)，恒温浴槽购自宁波江南仪器厂，JH-280425张力换能器由福建医科大学生理实验室提供。其他组件包括倒置显微镜、摄像机、监视器、示波器记录仪、光源，均由尼康公司提供。试剂氯化钾(potassium chloride，KCl)、去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)、 乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)由厦门鹿茸公司提供。

2.动物分组及实验设计：实验动物分A、B两组，A组为12周龄雌性未孕SD大鼠， B组为12周龄雌性妊娠大鼠，妊娠时间18天，每组大鼠8～10只。两组大鼠的腹主动脉舒缩功能采用新型双针套接式测量仪和传统金属丝挂钩式测量仪分别测量，明确对于同组大鼠的腹主动脉舒缩功能，采用新型测试仪与传统仪器是否有差异；同时将采用相同测量仪器检测的不同组的大鼠腹主动脉舒缩功能做比较，明确不同组的大鼠腹主动脉的舒缩功能是否发生变化，如果有差异，两种仪器测得的差异趋势是否一致。两组大鼠的子宫动脉无法采用传统测量仪测量，仅采用新型微动脉测试仪测量，明确不同组大鼠子宫动脉的舒缩功能是否发生变化，如果存在差异，这种差异与两组大鼠腹主动脉功能的差异趋势是否一致。

3.大鼠离体动脉血管环制备以及装置的连接：大鼠处死，取肾动脉开口水平至髂动脉分叉处之间的腹主动脉管段，长度约3mm，同时取大鼠自子宫中央区向外侧第2个胚胎所属的子宫动脉的血管段[6]，长度约3mm，血管段浸入4℃的Kreb液保存备用。采用新型仪器测量时，将制备好的离体动脉段浸泡于仪器的37℃恒温水浴槽内，置于显微镜的视野中心，血管段一端首先用精细显微外科镊套接在固定软针尖端上，用10-0眼科尼龙单丝将其固定，从固定软针向血管腔内缓慢注入Kreb液，直至将血管腔中的血液以及杂质完全去除，血管段另一端朝向可伸缩软针尖端，将可伸缩软针推向血管段的游离端，直至可伸缩软针尖端也套入血管段，用10-0眼科尼龙单丝固定此端。将连接可伸缩软针的输液管外接到输液袋上，袋中静水压保持在90mmHg。

4.检测步骤：动脉收缩功能检测：采用51mmol/L氯化钾溶液(51mmol/L KCl)刺激动脉段/环2min，绘制时间-收缩百分比曲线；动脉舒张功能检测：采用3×10-7mol/L的NE预收缩5min，待血管的收缩达到平台值并趋于稳定后依次加入浓度梯度为10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L的ACh溶液，绘制剂量-舒张曲线[7,8]。每只大鼠的腹主动脉段均取两份，一份采用传统仪器测量，一份采用新型仪器测量，比较两种方法测得的动脉舒张、收缩功能曲线。大鼠的子宫动脉仅采用新型仪器测量。

5.组织学检测：将测量后的血管段/环制成石蜡切片，苏木素-伊红(haematoxylin-eosin, HE)染色后，在光学显微镜下观察血管壁的完整性以及血管内膜情况。

6.血管舒缩程度计算公式:血管收缩百分比= [(静息直径 - 收缩直径)/静息直径]×100%；血管舒张百分比=[(舒张直径-NE预收缩直径)/(静止直径 - NE预收缩直径)]×100%[6,7]。

结 果

1.腹主动脉舒张功能检测结果：采用传统方法导出的A组大鼠与B组大鼠腹主动脉的ACh舒张百分比曲线差异有统计学意义(P<0.05)，B组的腹主动脉对于ACh的舒张反应小于A组(图1A)。采用新型仪器导出的A组与B组大鼠腹主动脉的ACh舒张百分比曲线差异有统计学意义(P<0.05)，B组大鼠的腹主动脉对于ACh的舒张反应小于A组(图1B)。采用两种方法导出的A组大鼠腹主动脉在不同浓度梯度ACh作用下的剂量-舒张百分比曲线相近，差异无统计学意义(P=0.645，图1C)。同样，采用两种方法导出的B组大鼠腹主动脉的ACh舒张百分比曲线相近，差异无统计学意义(P=0.793，图1D)。

图1 腹主动脉舒张功能测量A.采用传统仪器测量大鼠腹主动脉舒张功能；B.采用新型仪器测量大鼠腹主动脉舒张功能；C.两种方法绘制的A组大鼠腹主动脉剂量-舒张曲线比较；D.两种方法绘制的B组大鼠腹主动脉剂量-舒张曲线比较

2.腹主动脉收缩功能检测结果：采用传统仪器导出的A、B组大鼠腹主动脉对于KCl的时间-收缩百分比曲线差异无统计学意义(P=0.993，图2A)。采用新型仪器导出的两组大鼠腹主动脉对于KCl的时间-收缩百分比曲线比较差异无统计学意义(P=0.472，图2B)。采用两种方法导出的A组大鼠腹主动脉对于KCl的时间-收缩百分比曲线相近，差异无统计学意义(P=0.320，图2C)。同样，采用两种方法导出的B组大鼠腹主动脉对于KCl的时间-收缩百分比曲线相近，差异无统计学意义(P=0.992，图2D)。

图2 腹主动脉收缩功能测量A.采用传统仪器测量大鼠腹主动脉收缩功能；B.采用新型仪器测量大鼠腹主动脉收缩功能；C.两种方法绘制的A组大鼠腹主动脉时间-收缩曲线比较；D.两种方法绘制的B组大鼠腹主动脉时间-收缩曲线比较

3.子宫动脉收缩功能检测结果：采用新型仪器导出的两组大鼠子宫动脉对于KCl的时间-收缩百分比反应曲线相近，差异无统计学意义(P=0.999，图3A)。

4.子宫动脉舒张功能检测结果：采用新型仪器导出的两组大鼠子宫动脉的ACh的舒张百分比曲线比较，差异有统计学意义(P<0.05)，B组大鼠的子宫动脉对于ACh的舒张反应小于A组(图3B)。

图3 子宫动脉舒缩功能测量A.采用新型仪器测量大鼠子宫动脉收缩功能；B.采用新型仪器测量大鼠子宫动脉舒张功能

5.组织学评估：采用新型仪器检测过的大鼠腹主动脉(图4A、图4C)以及子宫动脉(图4E、图4F)，血管壁完整，未发现内膜损伤；而采用传统仪器测量的大鼠腹主动脉(图4B、图4D)可发现血管内膜甚至血管平滑肌的损伤。

讨 论

图4 组织学评价A.采用新型仪器测量的A组大鼠腹主动脉；B.采用传统仪器测量的A组大鼠腹主动脉；C.采用新型仪器测量的B组大鼠腹主动脉；D.采用传统仪器测量的B组大鼠腹主动脉；E.采用新型仪器测量的A组大鼠子宫动脉；F.采用新型仪器测量的B组大鼠子宫动脉

微小动脉的功能改变可能直接影响下游靶器官，因此在研究中更多采用外周微小动脉而不是中央大动脉作为靶器官功能改变的上游研究对象[9,10]。传统的双金属丝挂钩式微小动脉功能测量装置存在如下缺陷：(1)忽略了血管口径和血管壁的厚度差异，对血管环各部分所造成的牵拉程度不一致，得到的数据无法真实的反应实际情况[1,11～13]。(2)传统检测仪的金属丝直径约100μm左右，易对血管内膜造成损伤，当被测动脉内径小于300μm时，很难将两根金属丝同时穿入血管环[8～12]。若缩小金属丝口径，过细的金属丝无法承受血管环的拉力。(3)忽略了血管腔内血压对血管内壁的影响。(4)在装置内，血管腔内外的生物活性液是相交通的，施加干预时，无法分辨干预因素是对外膜起效还是对内膜起效。(5)金属丝本身的性质差异有可能影响实验的结果[14～16]。

采用双针套接式微血管测量装置可以不受上述因素影响，其优势如下：(1)可精确模拟生理或病理状态的血管腔内血压，并可自由调整被测血管的前负荷。(2)可测量口径300μm以下的微小动脉。本实验中被测量的微小动脉的最小口径为230μm。套接软针针头组件可以根据被测血管的口径进行个体化更换。(3)采用本装置进行实验时，操作仅限于血管段的两端，中间段被测血管的内膜不会受到损伤。(4)血管腔内的生物活性液与恒温浴槽内的生物液不相交通，可以对被测血管的外膜和内膜独立施加干预因素。

本研究显示，妊娠期大鼠，不论子宫动脉还是腹主动脉，对于ACh介导的舒张性均小于未孕的大鼠，提示在妊娠状态下，大鼠动脉对ACh 诱导的内皮依赖性舒张明显降低，间接说明在妊娠状态下，大鼠血管内皮舒张功能下调，更易引发妊娠期高血压。比较腹主动脉和子宫动脉，妊娠期ACh 诱导的内皮依赖性舒张差异无统计学意义。既往研究报道在缺血、缺氧的妊娠大鼠模型中，大鼠主动脉对于ACh诱导的舒张功能显著下降，提示缺血、缺氧状态导致了血管内皮舒张功能障碍，从而进一步加剧妊高症的发展[17]。而本研究结果提示，妊娠状态本身也许就是妊高症的独立诱因。对于KCl诱导的收缩，不论是腹主动脉还是子宫动脉，两组均未表现出差异，提示在妊娠期，KCl介导的电压门钙通道可能未受影响，或者有其他通路代偿了该通路的功能。本研究将同组的大鼠腹主动脉用两种方法测量，不管是对于KCl诱导的时间-收缩曲线，还是ACh诱导的剂量-舒张曲线，两种方法测得的结果比较差异无统计学意义，提示新的测量方法与已认可的传统方法比较，差异无统计学意义。同时，采用同种测量方法测量不同组的大鼠腹主动脉，对于传统测量方法已测得的差异，采用新测量仪器同样可测出相同趋势的差异。对于口径小于300μm的微小血管在妊娠期血管内皮舒缩功能改变的报道鲜见。笔者选取口径为200～300μm的大鼠子宫动脉作为研究对象，用新型仪器绘制其对KCl及ACh的反应曲线，结果显示雌性大鼠子宫动脉对于ACh介导的内皮舒张功能在妊娠期显著下调，填补了此领域空白。

当然，本研究也存在不足之处：(1)测量指标有限。在后继的研究中，笔者还将加入左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)、吲哚美辛(indomehacin)等干预因素，使实验趋向系统性[10,13,18,19]。(2)选取的微小动脉较单一。

综上所述，本研究所述的双针套接式微小动脉测量装置不仅可以代替传统的微小动脉测量仪，还可以测量传统仪器无法测量的口径更小的微小动脉，拥有广泛的应用前景，有望成为临床以及药理实验中测量血管功能的主流装置。