USP14在结直肠癌中的表达及临床意义

韩秋月 章 霞 章文龙 张坚刚 周文君 林爱芬

结直肠癌是常见恶性肿瘤之一，男性发生率居第三位，女性发生率居第二位[1]。近年来，结直肠癌治疗已经取得重大进展，但治愈率和长期生存率几乎没有变化，仍存在诸多问题，如早期诊断缺乏特异性标志物、转移风险高、缺乏有效治疗的特异性靶点等[2]。泛素特异性蛋白酶14(ubiquitin-specific protease 14，USP14)由494个氨基酸组成，相对分子质量约为56 kDa，主要分布于细胞质和细胞膜[3]。USP14含有一个N端UBL结构域，与USP14和蛋白酶体之间的结合有关[4]。本研究利用免疫组化法检测结直肠癌组织中USP14表达情况及分析其与临床病理参数的相关性，进一步分析USP14与结直肠癌患者预后关系，探讨USP14在结直肠癌中的作用。

材料与方法

1.标本收集：选取2005年9月～2011年8月浙江省台州医院确诊并行结直肠癌根治术患者肿瘤组织样本225例及对应的正常组织225例，经石蜡包埋后储存于浙江省台州医院生物资源中心。其中，男性122例，女性103例，患者年龄28～90岁，平均年龄63岁。病理分期按AJCC第7版制定的TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期126例，Ⅲ～Ⅳ期99例。所有患者术前均未进行放化疗、药物等治疗。所有标本均已取得患者知情同意，并通过浙江省台州医院伦理学委员会审核。

2.主要试剂和方法：兔抗人多克隆抗体USP14购于美国Sigma公司，采用免疫组化法检测结直肠癌组织及对应远端正常组织中USP14表达情况。切片后，60℃烘烤过夜，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化。3%过氧化氢孵育15min，0.01mol/L枸橼酸盐(pH值6.0)高压热修复。1%BSA封闭非特异性抗原，USP14抗体4℃孵育过夜，过氧化物酶标记的抗兔第二抗体37℃孵育30min。DAB显色，苏木精复染。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，阅片。其中，肺癌组织作为阳性对照，TBS溶液替代USP14抗体作为实验阴性对照。

3.判断标准：免疫组化结果分别由两名病理科医生进行阅片。以淡黄色至棕黄色染色为阳性，结果按照阳性细胞百分比进行评分。随机选择10个高倍镜视野，计算阳性细胞百分数。阳性细胞数<5%为阴性，阳性细胞数≥5%为阳性。

4.统计学方法：采用SPSS 23.0统计学软件对数据进行统计分析。采用χ2检验分析USP14表达和临床病理参数相关性，Kaplan-Meier法用于生存分析，COX回归模型用于多因素分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1. 结直肠癌组织中USP14的表达情况：USP14表达于细胞质内(图1)。结直肠癌组织中USP14表达率为67.6%(152/225)，正常组织中表达率为42.2%(95/225)。结直肠癌组织中USP14表达显著高于正常组织(χ2=11.62，P<0.05)。

图1 结直肠癌组织USP14表达结果(免疫组化，×400)A.结直肠癌组织阳性表达；B.结直肠癌组织阴性表达；C.正常组织阳性表达；D.正常组织阴性表达

2.USP14表达和临床病理参数相关性：USP14表达与临床病理参数分析表明，其与性别(χ2=0.205，P=0.651)、年龄(χ2=1.274，P=0.259)、远处转移(χ2=0.739，P=0.390)、TNM分期(χ2=3.082，P=0.079)均无显著相关性(表1)。

表1 USP14表达与临床病理参数相关性

3.USP14表达与结直肠癌患者预后的关系：225例结直肠癌患者进行生存分析表明，USP14表达阳性患者的平均生存时间63.78个月(95% CI：57.37～70.19个月)，USP14表达阴性的患者平均生存时间83.09个月(95% CI：75.40～90.78个月)。USP14阳性患者生存时间明显短于阴性患者，差异有统计学意义(χ2=8.664，P=0.003，图2)。

图2 结直肠癌患者USP14表达Kaplan-Meier生存分析

为进一步分析USP14表达与患者预后关系，采用COX比例风险模型分析。单变量分析结果表明USP14表达(阳性vs阴性，HR=2.310，P=0.001)和TNM分期(Ⅲ～Ⅳ期 vs Ⅰ～Ⅱ期，HR=3.377，P=0.000)与患者不良预后显著相关。多变量分析结果显示USP14表达(HR=2.213，P=0.002)和TNM分期(HR=3.237，P=0.000)可作为结直肠癌患者的独立预后因子(表2)。

讨 论

蛋白质稳态是调控多种细胞功能的关键。细胞中有两大系统负责调控蛋白质降解，即泛素蛋白酶体系统(UPS)和溶酶体系统。泛素蛋白酶体系统包含泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme，E2)、泛素连接酶(ubiquitin-protein ligating enzyme，E3)及26S蛋白酶体。泛素连接酶将泛素单体与其靶蛋白的赖氨酸残基通过共价键连接，也可通过将泛素单体逐一连接到前一个泛素分子的7个内部赖氨酸残基(K6/K11/K27/K29/K33/K48/K63)上，将单泛素链转化为多聚泛素链。而去泛素化酶可以从目标蛋白上分解这些单肽和多肽链[5]。研究表明，去泛素化酶通过稳定关键蛋白，在恶性细胞的增殖、运动和耐药中发挥重要作用[6]。哺乳动物蛋白酶体与3个重要的去泛素化酶相关：RPN11、UCH37、USP14[7]。RPN11是19S调控元件亚基，UCH37和USP14可与19S蛋白酶体可逆结合[8]。

USP14属于泛素特异性蛋白酶家族，其编码基因位于第18号染色体短臂18p11.32区，是靠近端粒处的功能基因，对机体生命过程具有重要作用。在真核细胞中，26S蛋白酶体是蛋白质降解的主要位点。哺乳动物细胞26S蛋白酶体中，USP14约占10%～20%。虽然只有一小部分的19S颗粒含有USP14，但细胞中绝大多数USP14都与蛋白酶体结合[9]。USP14参与体内蛋白质降解的调控，参与恶性肿瘤进展，但其具体作用机制还未完全阐明。

USP14是哺乳动物中高度保守的去泛素化酶，因其在多种肿瘤中的高表达和重要作用而受到越来越多的关注。Tian等[8]研究发现USP14在多发性骨髓瘤细胞中高表达，b-AP15处理多发性骨髓瘤细胞可有效抑制USP14，阻断细胞周期进程，诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡。USP14在上皮性卵巢癌组织中USP14表达水平明显升高，与肿瘤分级、肿瘤阶段、淋巴结转移相关，与Ki-67表达呈正相关，USP14沉默可抑制上皮性卵巢癌细胞增殖并诱导细胞凋亡[10]。研究发现USP14在乳腺癌组织中高表达，其主要分布于乳腺癌细胞的细胞质中，与组织学分级、淋巴结转移相关[11]。USP14在非小细胞肺癌细胞中表达上调，尤其是在腺癌细胞中[12]。与邻近非肿瘤组织比较，食管鳞癌组织在RNA水平和蛋白水平上均出现USP14过表达，USP14表达与远处转移相关[13]。肝癌组织中USP14表达水平显著高于正常肝组织中USP14表达水平，其过表达可促进肝癌细胞增殖，抑制细胞凋亡，进而促进肝癌进展[14]。Ishiwata等[15]在结肠癌组织中发现USP14表达水平高于正常组织。

本研究采用免疫组化分析USP14在结直肠癌中的表达情况，研究显示结直肠癌肿瘤组织中USP14表达显著高于正常组织，USP14表达与性别、年龄、远处转移、TNM分期无显著相关，生存分析发现USP14表达阳性患者预后较差，可作为结直肠癌预后的独立危险因素。而Shinji等[16]研究表明结直肠癌患者USP14表达水平并不高，18.2%(18/99)患者为高表达，81.8%(81/99)为低表达，USP14表达与淋巴结转移情况、肝转移情况、TNM分期相关。这可能是由于本研究将结直肠癌组织USP14表达情况分为阴性和阳性两组。判断标准为阳性细胞数< 5%为“-”，阳性细胞数≥5%为阳性。而Shinji等[16]研究中“-”为未检测到USP14表达；“±”为弱于或与正常组织上皮细胞显色强度相当；“+”为显色强度强于正常组织上皮细胞。统计分析时将“-”组和“±”组归为低表达组，“+”归为高表达组。这可能是导致本研究与该文章统计结果差异的原因。

以往研究表明，USP14表达与患者生存率密切相关，USP14表达阳性患者预后较差[10～14]。Wang等[10]研究发现上皮性卵巢癌患者中USP14高表达与生存时间短显著相关，提示USP14可作为卵巢癌患者预后指标。Zhu等[11]研究表明，USP14高表达的乳腺癌患者生存期明显缩短，USP14表达沉默可以抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移，诱导细胞凋亡，淋巴结转移、USP14表达、Ki-67表达是患者整体生存的独立预后指标。Wu等[12]研究发现USP14沉默可抑制细胞生长和细胞周期，并伴随着β-catenin蛋白质水平大幅下降，肺腺癌患者USP14表达与生存期相关。Zhang等[13]研究发现USP14过表达与食管鳞癌患者整体生存率降低有关，表明USP14是总体生存的独立危险因素。Ying等[17]研究发现USP14高表达与胃癌患者不良预后相关，USP14表达水平是胃癌患者独立预后因子。此外，USP14沉默促进p-ERK和p-Akt蛋白酶体降解，从而阻断Akt和ERK信号通路，增加胃癌细胞对顺铂敏感度。与上述研究一致，本研究生存分析结果表明，相比于USP14阴性患者，USP14阳性患者的总体生存时间明显缩短。进一步COX比例风险回归分析发现，USP14表达和TNM分期可作为结直肠癌患者的独立预后因素。

综上所述，本研究USP14在结直肠癌中的表达和临床意义，研究表明USP14表达在结直肠癌发展中发挥重要作用，且USP14表达与预后相关，是结直肠癌患者独立预后指标，对结直肠癌预后判断具有重要价值。