泡菜发酵乳酸菌的分离鉴定及耐药性分析

2019-10-29孔令聪刘树明马红霞闵伟红

食品科学 2019年20期

党乔，孔令聪，刘洁，刘树明，魏星，马红霞,*，闵伟红,5,*

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118；2.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118；3.动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林长春 130118；4.辽源市动物疫病预防控制中心，吉林辽源 136220；5.小麦和玉米深加工国家工程实验室，吉林长春 130118）

乳酸菌是一类可通过发酵将碳水化合物转化为乳酸的微生物，由于其具有兼性厌氧的特性，可广泛存在于自然界中[1]。相关研究已证明乳酸菌不但可以调节微生态平衡、抗氧化，还具有缓解乳糖不耐症、预防肿瘤和癌症发生等益生功能[2]，其已广泛用于医疗、食品、工业等领域[3]。目前用于食品工业中的乳酸菌主要包括乳酸杆菌、乳酸球菌、链球菌、明串珠菌等[4]。

随着国内外学者对乳酸菌研究的不断深入，更加推动了乳酸菌制品的广泛流行。但是由于乳酸菌缺乏严格的功效性和安全性认定标准，已经引发了一系列潜在的风险。其中，劣质乳酸菌可能导致耐药基因传播以及诱发致病菌产生耐药性的问题，已经引发了相关学者的高度关注[5]。虽然乳酸菌在食品发酵、青贮饲料等领域具有悠久的历史[6]，但研究发现，有些乳酸菌不但对临床常用药物产生了抗药性，还有可能将其携带的耐药基因通过食物链传递给其他肠道及呼吸道致病菌，并赋予其耐药性[7]。

泡菜是以蔬菜为原料通过乳酸菌发酵制得的传统食品[8]，因其具有独特的口感、高营养价值和易于储存的优点，深受人们喜爱。但其在食用之前并不经过灭菌处理，造成大量的乳酸菌进入人体[9]。因此，亟需对市售的泡菜发酵菌种进行分离鉴定，并对其耐药性进行检测，以期为乳酸菌安全性评估和泡菜质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

样品为吉林地区朝鲜族自制泡菜；细菌DNA基因组抽提试剂盒生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 培养基

MRS固体培养基、MRS液体培养基、Mueller-Hinton Broth（M-H肉汤）、Mueller-Hinton Agar（M-H琼脂）青岛海博生物技术有限公司。

1.1.3 抗生素

氨苄西林、庆大霉素、卡那霉素、红霉素、氯霉素、四环素北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；环丙沙星、左氧氟沙星、头孢曲松、头孢呋辛、克林霉素中国兽医药品监察所；链霉素、环丙沙星、左氧氟沙星上海易恩化学技术有限公司。

1.2 仪器与设备

恒温空气浴摇床常州国旺仪器制造有限公司；超净工作台苏州安泰空气技术有限公司；数显恒温水浴锅丹阳门石英玻璃场；微量分光光度计美国Thermo公司；超低温冰箱中国海尔集团；琼脂糖凝胶电泳仪北京市六一仪器厂；旋涡混合器海门市麒麟医用仪器场。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌分离纯化

将采集到的泡菜汁置于无菌超净工作台中，使用生理盐水，将样品10 倍梯度稀释，分别取10-5、10-6、10-7三个梯度的稀释液100 μL均匀涂布在含有2%碳酸钙的MRS培养基上，将涂布好的培养基置于厌氧罐中，37 ℃培养48 h。挑取有明显溶钙环的不同形态菌落接种在相应的液体培养基中增菌培养24 h，再次划线接种在MRS固体培养基上，经分离纯化3 次后，挑取单个菌落，进行过氧化氢酶实验和革兰氏染色。将革兰氏染色为阳性，过氧化氢实验为阴性的菌落增菌培养，在MRS液体培养基（含20%甘油）中-80 ℃保存。所有菌株在使用前都经过3 次传代培养。

1.3.2 乳酸菌16S rDNA基因测序鉴定1.3.2.1 乳酸菌DNA的提取

使用生工生物工程（上海）股份有限公司细菌DNA基因组抽提试剂盒提取分离菌株的基因组。

1.3.2.2 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增乳酸菌16S rDNA基因序列

使用16S rDNA通用引物，正向序列：27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；反向序列：1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT。PCR体系为50 μL，2×Taq PCR MasterMix 25 μL，DNA模板4 μL，引物27F 2 μL，引物1492R 2 μL，加水补充至50 μL。

PCR扩增程序设置如下，预变性：94 ℃、5 min；变性：94 ℃、30 s；退火：55 ℃、30 s；延伸：72 ℃、90 s；30 个循环；末端延伸：72 ℃、10 min。

1.3.2.3 PCR扩增产物检测及测序

取2.5 μL PCR扩增产物，经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，在1 500 bp处有清晰条带的样品送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序分析。将得到的测序结果采用BLAST与NCBI中的数据进行比对确定其属种。

1.3.3 抗生素敏感性实验

参照临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐的琼脂稀释法测定所分离乳酸菌对10 种抗生素的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。采用二倍稀释法，制备抗生素质量浓度为512～0.031 25 μg/mL且加入5%血清的MH琼脂固体平板。所有待测菌株浓度调整为1×106CFU/mL，使用多点接种仪接种于含有不同抗生素的琼脂培养基上，37 ℃中培养24 h。使用大肠埃希氏菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923作为质控株，每批实验均使用质控株作为对照，并要求质控株MIC在CLSI规定范围内。使用不加抗生素的琼脂平板作为空白对照。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌序列同源性比对结果

从1 5 份样品中共分离出3 4 株乳酸菌，经16S rDNA测序分析，其分别属于3 个属13 种。分别为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）12 株，鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）3 株，弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）1 株，干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）2 株，棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）1 株，短乳杆菌（Lactobacillus. brevis）5 株，嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）1 株，清酒乳杆菌（Lactobacillus sake）2 株，肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）2 株，嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）2 株，食窦魏斯氏乳杆菌（Weissella crbaria）1 株，坚强肠球菌（Enterococcus durans）1 株，Lactobacillus namurensis1 株。16S rDNA测序结果经NCBI BLAST比对结果如表1所示。结果表明泡菜中乳酸菌种类繁多，植物乳杆菌是本次采集的泡菜样品中的优势菌株。

表1 乳酸菌16S rDNA序列同源性比对结果Table 1 Homologous analysis of lactic acid bacteria by 16S rDNA sequencing

2.2 乳酸菌对抗生素敏感性实验

采用琼脂稀释法检测从泡菜中分离到的34 株乳酸菌对氨苄青霉素、卡那霉素、链霉素、庆大霉素、氯霉素、红霉素、克林霉素、四环素、左氧氟沙星、环丙沙星的敏感性。被测菌株的MIC如表2所示，药物敏感性判断标准参照欧洲食品安全管理局（European Food Safety Authority，EFSA）[10]和Wang Jing等[11]。

表2 乳酸菌对10 种抗生素的MIC检测结果Table 2 Minimum inhibitory concentrations of lactobacilli when exposed to ten antibiotics

结果表明，分离得到的34 株乳酸菌均表现出不同程度的耐药性。对环丙沙星（85.29%，29/34），左氧氟沙星（61.76%，21/34），卡那霉素（52.94%，18/34），链霉素（50%，17/34），庆大霉素（29.41%，10/34），克林霉素（38.23%，13/34），红霉素（20.5%，7/34），四环素（20.5%，7/34）均表现出不同的耐药性。对氨苄青霉素和氯霉素全部敏感，对氨苄青霉素MIC不大于2 μg/mL，对氯霉素MIC不大于4 μg/mL。所测菌株对抗生素的耐药情况为环丙沙星＞左氧氟沙星＞卡那霉素＞链霉素＞克林霉素＞庆大霉素＞红霉素＞四环素＞氯霉素=氨苄青霉素。

2.3 乳酸菌多重耐药性分析

大多数的乳酸菌都表现为多重耐药，只有1 株鼠李糖乳杆菌和1 株肠膜明串珠菌对单一抗生素耐药，其余菌株均对多种抗生素耐药。5 株乳酸菌对2 种抗生素耐药，7 株乳酸菌对3 种抗生素耐药，12 株乳酸菌对4 种抗生素耐药，4 株乳酸菌对5 种抗生素耐药，1 株乳酸菌对6 种抗生素耐药，乳酸菌耐药表型分析如表3所示。乳酸菌多重耐药性存在个体间差异，大多数乳酸菌均对环丙沙星、左氧氟沙星、链霉素耐药。

表3 乳酸菌多重耐药性Table 3 Multiple drug resistance of lactobacilli

2.4 不同菌种耐药情况分析

本实验分离出植物乳杆菌数量最多为12 株，除6-1外，其余植物乳杆菌均对环丙沙星耐药，5 株对左氧氟沙星和庆大霉素耐药，9 株对链霉素耐药，3 株对克林霉素耐药，6 株对卡那霉素和红霉素耐药。分离得到短乳杆菌5 株，全部对环丙沙星和左氧氟沙星耐药，30-1对四环素和红霉素耐药，27-1-2对四环素耐药，26-2对卡那霉素耐药，25-3对庆大霉素和链霉素耐药，28-2对红霉素和克林霉素耐药。2 株鼠李糖乳杆菌耐药性较低，仅对卡那霉素和左氧氟沙星耐药。肠膜明串珠菌1-1仅对环丙沙星耐药，P2对四环素、庆大霉素、左氧氟沙星、环丙沙星耐药。干酪乳杆菌28-4和Z3均对卡那霉素和左氧氟沙星耐药。2 株清酒乳杆菌耐药谱相同，均对克林霉素、链霉素、庆大霉素、左氧氟沙星耐药。2株嗜热链球菌和两株干酪乳杆菌耐药谱差异均较大。棒状乳杆菌5-5、嗜酸乳杆菌4-1、坚强肠球菌32-1均对克林霉素、左氧氟沙星、环丙沙星耐药，但也存在对其他抗生素耐药性差异。

3 讨论

3.1 泡菜中乳酸菌分离鉴定

泡菜是以新鲜蔬菜为原料，加入一定量的食盐，在乳酸菌和酵母等微生物的厌氧发酵下，形成的有独特口感的发酵食品[12]。国内外多名学者均从泡菜中分离得到大量乳酸菌。Xiong Tao[13]和邓维琴[14]等研究表明泡菜发酵过程中优势乳酸菌主要包括Lactobacillus pentosus、L. plantarum、L. brevis、Lactobacillus citreum和Leuconostoc mesenteroidessubsp.。孟令帅等[15]以沈阳地区泡菜为原料，从中分离得到2 个属6 种乳酸菌。本实验以吉林地区传统朝族泡菜为材料，分离得到3 个属13 种乳酸菌，共计34 株。与上述报道略有差异，没有分离得到L. pentosus和L. citreum，但是得到了泡菜中较为不常见的W. crbaria、E. durans和L. namurensis。这一差异结果可能与吉林地区特有的地理及气候条件有关，不同环境中微生物种类和生物学特性有明显差异，因此导致吉林地区泡菜中优势乳酸菌有独特的地域特性，并且各家庭制作泡菜所用原料、制作工艺、温度、时间存在差异，导致不同地区样品中乳酸菌种类不同。本实验探究了吉林地区泡菜中乳酸菌种类及优势菌株，为吉林地区泡菜乳酸菌多样性研究提供了参考，也为筛选出优良的泡菜发酵乳酸菌奠定了基础。

3.2 乳酸菌耐药性

从吉林地区泡菜中分离得到34 株乳酸菌，采用琼脂稀释法检测了10 种临床常用抗生素的药物敏感性，结果显示34 株乳酸菌对环丙沙星、左氧氟沙星、卡那霉素、链霉素耐药率较高，对庆大霉素、克林霉素、红霉素、四环素等均呈现不同程度的耐药性，分离菌仅对氨苄西林和氯霉素全部敏感。大量研究表明，乳酸菌通常对抑制蛋白质合成的抗生素敏感，如氯霉素、红霉素、克林霉素和四环素，也对细胞壁合成抑制剂如β-内酰胺类抗生素敏感[16-18]。但乳杆菌对大多数核酸抑制剂，如环丙沙星、诺氟沙星、左氧氟沙星等以及氨基糖苷类抗生素，如链霉素、卡那霉素、庆大霉素等通常具有耐药性[19-20]。其耐药机制主要受乳酸菌存在的药物外排系统、甲基转移酶以及产生的药物灭活酶所介导[21-22]。本次实验结果与之前相关学者报道较一致[11,23-25]。但是Zhou[26]和张宏梅[27]等的药敏结果显示，受试乳酸菌对氨苄西林耐药率较高，凡琴[28]、Moschetti[29]等发现所检测的乳酸菌对庆大霉素较敏感。其不同的药物敏感性结果可能与不同地区、不同环境中微生物面临和承受的抗生素污染状况不同有关，因此，不同地区、不同来源的乳酸菌应进行单独分析。

总之，蔬菜通常被认为是绿色安全食品，泡菜一般由蔬菜表面附着的乳酸菌发酵而成，很少会单独添加乳酸菌制剂。由于抗生素的长期使用和过度使用，环境中抗生素污染日益严重，且蔬菜在培育过程中受到化肥、浇灌用水、土壤等中的抗生素污染，导致了蔬菜表面的微生物产生了巨大的选择压力[30]。尤其在泡菜的制作过程中一般不会加入特定的乳酸发酵剂，仅由蔬菜表面的乳酸菌群发酵而成，使得耐药性乳酸菌随食物链进入人体，对人体健康造成潜在危害。因此，本实验对泡菜中乳酸菌耐药情况进行分析，对环境中乳酸菌的安全性评估，及具有优良风味的安全乳酸菌发酵剂的筛选具有重要意义。