亚麻籽胶对儿茶素-肌原纤维蛋白热诱导凝胶特性的影响

贾 娜，张风雪，孙 嘉，宋 立，刘登勇*

（渤海大学食品科学与工程学院，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁 锦州 121013）

肌原纤维蛋白是肌肉蛋白质的主要成分，是一种具有功能特性的蛋白质，除维持肌纤维的形状、参与肌肉的收缩外，其热诱导凝胶还对肉制品的硬度、弹性和保水性等方面有重要影响[1]。蛋白质在加工、贮藏、运输等过程中会发生氧化，是除微生物污染、脂肪氧化之外影响肉品品质的又一重要因素，有研究表明，通过加入多酚类天然抗氧化剂可抑制肉类蛋白质的氧化程度[2-3]。但是，多酚在发挥其抗氧化作用的同时，还能与蛋白质以非共价或共价方式发生相互作用[4]。其中非共价相互作用是可逆的，主要包括多酚与蛋白质分子间的氢键、疏水相互作用和范德华力等[5]；共价作用是不可逆的，如高浓度的绿茶提取物能与猪肉肌原纤维蛋白中的巯基发生共价交联，生成巯基-醌加成物，从而阻止了蛋白质之间交联形成二硫键[6]。多酚与蛋白质之间的相互作用一方面会改变蛋白质的结构，另一方面会对蛋白质的功能特性产生不利影响。如高浓度的绿原酸能够削弱肌原纤维蛋白的凝胶性能[7]；1.25 mmol/L的迷迭香酸能够阻断肌原纤维蛋白的巯基交联，破坏蛋白质凝胶化，使其保水能力和凝胶强度降低[8]。因此，有必要研究在以多酚为抗氧化剂的同时如何减轻其对蛋白质功能特性的不利影响。

食品工业中常添加具有乳化、增稠、保水等性质的亲水胶体（如黄原胶、魔芋胶等）改善肉制品的品质。其中亚麻籽胶是一种具有弱凝胶性、乳化性、亲水性等性质的天然亲水胶体[9]。研究表明，亚麻籽胶可增强肌原纤维蛋白体系中的静电作用，显著提高肌原纤维蛋白凝胶保水性[10]，且其浓度越高，凝胶硬度越大[11]。在较高的pH值下，亚麻籽胶还可以降低凝胶速率，有助于形成细密的凝胶网络，提高凝胶强度[12]。前期研究发现，具有较强抗氧化作用的天然抗氧化剂儿茶素降低了肌原纤维蛋白的凝胶性能。因此，在此基础上，本研究向儿茶素-肌原纤维蛋白体系中添加亚麻籽胶，研究不同含量的亚麻籽胶对蛋白凝胶特性及二级结构的影响，探究亚麻籽胶能否改善儿茶素对蛋白凝胶特性的不利影响，以期为扩大多酚类物质在肉制品中的应用提供理论基础和应用指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜猪背最长肌（宰后24～48 h）购于当地超市。

亚麻籽胶为国产食品级；氯化镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、乙二胺四乙酸二钠、氢氧化钠、酒石酸钾钠、乙醇、戊二醛、叔丁醇等试剂均为国产分析纯；儿茶素 上海Aladdin化学公司。

1.2 仪器与设备

FE20 pH计、JB/7534电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；T25数显型均质机 德国IKA集团；HHS电热恒温水浴锅 山西省文水医疗器械厂；LabRAM HR Evolution共焦拉曼光谱仪 堀场（中国）贸易有限公司；S-4800场发射扫描电镜 日本日立公司；低场核磁共振分析仪 上海纽迈电子科技有限公司；TA-XT2i质构仪 英国Stable Micro Systems公司；Discovery DHR-1流变仪 美国TA公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纤维蛋白的提取和样品的制备

肌原纤维蛋白提取：按照Park等[13]的方法进行并适当修改。称取适量猪肉样品，加入4 倍体积的冰提取液（0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L乙二胺四乙酸、6.1 mmol/L Na2HPO4、3.9 mmol/L NaH2PO4，pH 7.0），匀浆60 s，3 500 r/min、4 ℃冷离心15 min，去上清液重复匀浆离心2 次，得到粗纤维蛋白沉淀；然后加入4 倍体积的冰洗液，匀浆60 s，在3 500 r/min冷冻离心15 min（4 ℃），去上清液重复匀浆离心1 次，得到粗纤维蛋白沉淀，再加4 倍体积冰洗液，匀浆60 s后用4 层纱布过滤，并用0.1 mol/L HCl溶液调pH值为6.0，随后3 500 r/min冷冻离心15 min（4 ℃），得到的沉淀置于塑封袋中4 ℃保存备用。

样品制备：将上述所得蛋白质稀释到20 mg/mL，加入0、50、100 μmol/g的儿茶素，然后加入0.1%～0.4%的亚麻籽胶，混合均匀，得到所需蛋白质溶液混合体系。

1.3.2 热诱导凝胶的制备

将配制好的蛋白质溶液装入密闭的玻璃瓶中（30 mm×50 mm），每组3 个平行，放入恒温水浴锅内72 ℃保持20 min，制备好的凝胶在室温下放置2 h后，放入4 ℃的冰箱过夜备用。在进行凝胶特性分析之前要从冰箱中取出放在室温（25～27 ℃）30 min。

1.3.3 凝胶强度的测定

肌原纤维蛋白凝胶质构特性的测定采用TA-XT plus型质构分析仪。质构分析仪采用的参数如下：测定模式选择下压距离，测试前速率为1 mm/s，测试中速率为2 mm/s，测试后速率为1 mm/s，下压距离为凝胶高度的5 mm，引发力为5 g，探头型号选择P/0.5。将待测样品置于测定平台上固定好，在室温下进行测定，每组样品进行3 次平行实验，取平均值。

1.3.4 凝胶保水性的测定

采用Salvador等[14]的方法测定凝胶保水性，并适当修改。准确称取离心管的质量，记为m0，取一定质量凝胶（5～10 g）放入离心管底部，准确称取此时离心管的质量，记为m1。4 ℃、3 000 r/min离心10 min，离心后小心用中性滤纸吸干离心管中凝胶析出的水分，再次准确称取离心管质量，记为m2。每组样品进行3 次平行实验，取平均值。计算公式如下：

1.3.5 低场核磁的测定

采用Bertram等[15]方法，并适当修改。利用低场核磁共振分析仪分析蛋白质的水合特性，通过研究蛋白质和水分中H1质子相互交换和迁移的规律，以表征蛋白质的水合特征。

样品的预处理：取约1.5 g处理好的肌原纤维蛋白于色谱瓶中，然后将其放入水浴锅中72 ℃加热20 min，随后取出室温放置2 h后放入4 ℃冰箱中过夜，测试之前室温放置30 min。

测试条件：质子共振频率为22 MHz，测量温度为32 ℃。首先确定测试参数为：重复扫描8 次，重复间隔时间TR为6 500 ms，采样间隔80 µs，回波个数12 000。每个样品平行测定6 次，实验重复3 次。

1.3.6 动态流变的测定

用Discovery DHR-1流变仪测定样品的动态学特性。首先将制备好的蛋白质溶液均匀涂布于测试平台，赶走气泡。测试参数为：频率0.1 Hz，应变力2%，上下夹缝1 mm，起始温度20 ℃，升温速率2 ℃/min，终止温度80 ℃。测定过程中，避免平板外蛋白与空气接触，盖上保护盖，用石蜡进行密封。每组3 个重复。测定指标为流变的弹性模量G’。

1.3.7 拉曼光谱的测定

拉曼光谱通过LabRAM HR Evolution共焦拉曼光谱仪测量，所使用功率约为100 mW，仪器用单晶硅进行频率校正，用50 倍长焦距镜头将激光聚焦到放于载玻片的凝胶样品上。光谱的获得条件为：狭缝200 μm，600 g/mm光栅，3 次扫描，积分时间30 s，分辨率2 cm-1，数据获取速度120 cm-1/min，获取的拉曼光谱在400～3 600 cm-1。每个样品测试3 次。测试完成后用仪器自带的软件Labspec对光谱进行平滑，多点基线校正去除荧光背景。取800～1 800 cm-1进行分析。根据苯丙氨酸环在1 001 cm-1伸缩振动强度作为内标进行归一化（其强度不随蛋白质结构变化而变化）。采用Alix等[16]的方法计算蛋白质不同二级结构（α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲）的含量。

1.4 统计分析

2 结果与分析

2.1 亚麻籽胶对儿茶素-肌原纤维蛋白凝胶强度和保水性的影响

从图1a可以看出，当不添加亚麻籽胶只添加儿茶素时，蛋白的凝胶强度高于对照组（P＜0.05），儿茶素含量增加，凝胶强度略有降低，但差异不显著（P＞0.05）；而图1b中，当不添加亚麻籽胶时，儿茶素含量增加使凝胶保水性降低，且均显著低于对照组（P＜0.05），因此，总体来说，儿茶素对蛋白质的凝胶特性有不利影响。魏小红[17]在研究儿茶素对鱼糜凝胶特性的影响时，发现添加一定量的儿茶素会提高链鱼鱼糜的蒸煮损失率，降低鱼糜凝胶的品质，这与本研究一致。从图1a可以看出，不添加儿茶素时（0 μmol/g），不同添加量的亚麻籽胶对凝胶强度无显著影响（P＞0.05）；儿茶素含量为50 μmol/g和100 μmol/g时，随着亚麻籽胶添加量的增加，凝胶强度先上升后下降，说明有儿茶素存在时，较低含量的亚麻籽胶可以增强凝胶强度，而较高含量则会降低凝胶强度，可能是因为过量的亚麻籽胶阻碍了蛋白之间的交联，使凝胶形成受到影响。这与Feng Meiqin等[18]在不同NaCl浓度下研究亚麻籽胶-蛋白复合凝胶的凝胶强度得出的结论一致。由图1b可以看出，向儿茶素-肌原纤维蛋白体系中添加亚麻籽胶能够使凝胶保水性也增强，且添加量越高，增加幅度越大，这可能是因为亚麻籽胶可以结合肌原纤维蛋白的氢键，抑制蛋白的降解，进而提高凝胶的持水能力。

图1 亚麻籽胶对儿茶素-肌原纤维蛋白凝胶强度（a）和凝胶保水性（b）的影响Fig. 1 Effects of flaxseed gum on gel strength (a) and water holding capacity (b) of catechins-myofibrillar protein

此外，从图1还可以看出，当添加0.1%～0.4%亚麻籽胶时，儿茶素含量为100 μmol/g时蛋白的凝胶强度和保水性均高于50 μmol/g，说明儿茶素含量较高时，添加亚麻籽胶改善蛋白凝胶强度和保水性的效果更明显，这可能是因为亚麻籽胶本身能形成强大的网络结构[19]，与儿茶素-蛋白互作后的网络结构交织，不但使凝胶强度显著增强，且将水分子笼络在网络结构中，增强了对水分的束缚力，从而也提高凝胶的保水性能。这与陈海华等[20]在研究亚麻籽胶与盐溶性肉蛋白作用过程中蛋白凝胶强度和保水性的变化规律一致。

2.2 亚麻籽胶对儿茶素-肌原纤维蛋白凝胶水合特性的影响

肌原纤维蛋白凝胶低场核磁衰减曲线拟合的弛豫时间T2分布为4 个峰，分别对应结合水、不易流动水和自由水3 种形态水。其中T2b（0～10 ms）表示蛋白质分子表面的极性基团与水分子紧密结合的水分子层，也称为结合水。T21（10～100 ms）和T22（100～1 000 ms）表示存在于肌纤丝及肌原纤维之间的不易流动水，占总水分的80%左右，T23（＞1 000 ms）表示存在于细胞外的间隙中能自由流动的水[21]。弛豫时间可以表明水分的自由度[22]，弛豫时间越短水分越不易流动，弛豫时间越长流动性越高。由于结合水含量一般不受影响，因此本实验对T2b不做讨论。

表1 亚麻籽胶对儿茶素-肌原纤维蛋白凝胶弛豫时间T2的影响Table 1 Effect of flaxseed gum on relaxation time T2 of catechins-myo fi brillar protein gel

由表1可以看出，未添加儿茶素时（0 μmol/g），所有凝胶的弛豫时间均小于1 000 ms，此时不含自由水；儿茶素含量为50 μmol/g时，凝胶开始出现自由水，加入0.1%亚麻籽胶后凝胶仍含自由水，但其弛豫时间缩短（P＜0.05），亚麻籽胶添加量增加至0.2%～0.4%时，自由水消失；儿茶素含量为100 μmol/g时，不管是否添加亚麻籽胶，所有凝胶均含自由水，但弛豫时间均低于仅添加100 μmol/g儿茶素的实验组凝胶。以上结果说明儿茶素含量增加使凝胶束缚水的能力降低；而随着亚麻籽胶添加量的升高，凝胶束缚水的能力又逐渐上升，这与凝胶保水性的结果一致。这可能是因为亚麻籽胶带负电荷的羧基基团和蛋白质中带正电团的氨基酸侧链发生相互作用引起的[23]。

弛豫峰比例的变化情况可以反映不同状态下水分群的相对含量，从而可以评估出不同状态下水分群迁移情况[24]。表2表示儿茶素含量分别为0、50 μmol/g和100 μmol/g时，不同添加量亚麻籽胶对凝胶弛豫峰比例分步P2的影响，所有凝胶的不易流动水均占绝大部分，这是因为在加热的作用下，肌原纤维蛋白质分子发生变性，经分子间和分子内相互作用发生交联聚集，然后再与体系中的水通过化学键合而形成凝胶三维空间网络结构，此时体系中的大部分自由水吸附填充在凝胶网络结构中，转变为不易流动水[25]。在不添加亚麻籽胶时，从P22可以看出，随着儿茶素含量的升高，不易流动水含量也随之减少，说明儿茶素的加入使凝胶束缚水的能力降低。未添加儿茶素时（0 μmol/g），加入亚麻籽胶使P21显著升高（P＜0.05），说明亚麻籽胶的加入提高了体系固定自由水的能力，热诱导过程中更多的水分被束缚在凝胶网络结构中，提高了不易流动水比例，从而增强凝胶保水性；儿茶素含量为50 μmol/g、亚麻籽胶添加量较低时，儿茶素发挥主要作用，此时水分的自由活度较高，但随着亚麻籽胶添加量的升高，自由水消失，不易流动水逐渐增加；在儿茶素含量为100 μmol/g时，自由水含量明显增加，但不易流动水仍占大部分，说明虽然儿茶素降低了凝胶束缚水的能力，但此时仍能形成完整的凝胶结构。综上所述，随着儿茶素含量的升高，凝胶自由水活度升高，与凝胶保水性结果一致；而加入亚麻籽胶后，可提高凝胶束缚水的能力，但随着儿茶素含量的升高，改善效果有所降低。

表2 亚麻籽胶对儿茶素-肌原纤维蛋白凝胶峰比例分步P2的影响Table 2 Effect of flaxseed gum on peak area ratio P2of catechinsmyo fi brillar protein gel

2.3 亚麻籽胶对儿茶素-肌原纤维蛋白流变特性的影响

储能模量G’又称弹性模量，反映样品的弹性，蛋白凝胶的G’越大则表示弹性越好。由图2可以看出，不添加儿茶素和亚麻籽胶的肌原纤维蛋白凝胶呈现典型的“几”字形，温度从20 ℃升高到50 ℃时，G’达到峰值，G’增大来自于肌球蛋白头部的接合[26]，在此阶段，松散的凝胶结构初步形成；随着温度的进一步升高，在温度为50～60 ℃时，G’下降，是由于肌球蛋白尾部逐渐展开，导致形成的半凝胶流动性大幅度增加，从而导致已形成的网络结构被破坏[27]；在温度为60～80 ℃之间，G’快速增加，主要原因是温度升高使肌球蛋白分子展开，蛋白质结构发生变化，引起蛋白质聚集和进一步交联，由半溶胶转变为弹性胶体，同时将具有黏弹性的溶胶状态的蛋白转变为具有弹性的凝胶网络结构[28]。从图4可以看出，随着儿茶素含量的升高，凝胶形成的能力越来越弱，尤其是100 μmol/g时，流变曲线40～50 ℃的峰值几乎消失。从图4a可以看出，仅添加亚麻籽胶时，G’在温度20～40 ℃范围内明显升高，这可能是亚麻籽胶与蛋白间的静电相互作用使得凝胶体系的弹性增加；并且此时肌原纤维蛋白的热变性温度提高了大约2 ℃，这可能是因为亚麻籽胶的亲水性能更好，在溶液加热过程中亚麻籽胶先充分展开，蛋白质分子的展开受到了阻碍，因此推迟了蛋白质的变性[19]。而从图4b、c可以看出，当加入儿茶素后，再添加亚麻籽胶对20～40 ℃范围内G’的影响较小。在凝胶形成后期，随着亚麻籽胶添加量的上升，G’逐渐增大，亚麻籽胶添加量为0.4%时达到最大，说明亚麻籽胶添加量的增加有利于最终形成较好的的凝胶网络结构，这可能是亚麻籽胶通过分子间作用力或者物理填充、包埋等方式，参与凝胶的形成。

相位角（tanδ）是损耗模量G’’与储能模量G’的比值，代表样品的总体黏弹性。tanδ值可以揭示凝胶网状结构的特性：tanδ越低说明形成的凝胶三维网状结构越好；反之，则说明网状结构较差[29]。如图4所示，温度在20～50 ℃左右时，蛋白凝胶的tanδ值逐渐增大，即黏性特征优于弹性特征的变化，可能由于在一定剪切强度下，蛋白质无序状态的分子趋向有序状态变化，因而黏度特征的变化趋势优于弹性特征的变化。在温度为50 ℃左右时产生一个拐点，这是由肌球蛋白变性引起的，肌球蛋白在凝胶网状结构的形成过程中发挥极其重要的作用[30]。温度在50～80 ℃时，曲线呈现下降至趋于平缓的趋势，此时弹性特征优于黏性特征，说明逐渐形成了弹性较好的三维网状凝胶结构。从图4还可以看出，加入亚麻籽胶后，在温度为20～50 ℃时，随着亚麻籽胶添加量的升高，tanδ值逐渐增加，说明凝胶的黏性升高，而弹性降低，此时并未形成完整的凝胶结构，以溶胶为主；升温结束后，所有处理组均形成了较好的凝胶结构，差异不明显。

图2 亚麻籽胶对儿茶素-肌原纤维蛋白流变特性的影响Fig. 2 Effect of flaxseed gum on rheological characteristics of catechins-myofibrillar protein gel

2.4 亚麻籽胶对儿茶素-肌原纤维蛋白凝胶二级结构的影响

在拉曼光谱中，蛋白质肽键（—CO—NH—）有几个特征振动模式：1 650 cm-1附近的酰胺I带和1 250 cm-1的酰胺III带，这两种条带在拉曼光谱中很容易辨认，峰的精确位置与蛋白质多肽链的二级结构有关，因此经常被用来估计蛋白质的二级结构[31]。加入亚麻籽胶和儿茶素后所形成的蛋白凝胶的拉曼光谱图见图3，可以看出经过不同处理后，1 650 cm-1附近的酰胺I和1 250 cm-1附近的酰胺III区域的蛋白质条带有所不同。酰胺I带主要包括3 个结构域：1 658～1 654 cm-1表示α-螺旋；1 680～1 665 cm-1表示β-折叠；1 665～1 660 cm-1表示无规卷曲[32]。通过酰胺I带可以进行蛋白质二级结构分析，定量分析结果见表3。

如表3所示，当不添加亚麻籽胶时，随着儿茶素含量的升高，凝胶中的α-螺旋减少，β-折叠增加。蛋白质多肽链的羰基氧和氨基氢形成的氢键维持蛋白的α-螺旋[33]，因此加入的儿茶素与蛋白质羰基或者氨基的相互作用可能会降低多肽链之间形成氢键的能力[34]，从而导致α-螺旋含量降低。当加入不同含量的亚麻籽胶后，α-螺旋的含量均增加，β-折叠、β-转角和无规卷曲均降低，说明亚麻籽胶的加入促进蛋白质分子间氢键的形成，α-螺旋是最终形成凝胶中的主要结构[35]；当儿茶素含量为0 μmol/g和100 μmol/g、亚麻籽胶添加量为0.1%～0.3%时，随着亚麻籽胶添加量的升高，α-螺旋逐渐降低，β-折叠和无规卷曲增加，这可能是因为亚麻籽胶与肌原纤维蛋白间的静电相互作用使蛋白溶液的α-螺旋展开，在形成凝胶时转变为β-折叠、无规卷曲。这与潘丽华等[9]在研究不同温度下亚麻籽胶对肌原纤维蛋白凝胶特性的影响时，蛋白质二级结构的变化一致。

图3 不同处理组凝胶的拉曼光谱图（800～1 800 cm-1）Fig. 3 Raman spectra of catechins-myo fi brillar protein with different amounts of flaxseed gum added

表3 亚麻籽胶对儿茶素-肌原纤维蛋白凝胶二级结构的影响Table 3 Effect of flaxseed gum on secondary structures of catechinsmyo fi brillar protein

3 结 论

儿茶素降低了肌原纤维蛋白的凝胶性能，添加较低含量的亚麻籽胶可以增强蛋白的凝胶强度，而较高含量的亚麻籽胶降低了凝胶强度，但增强了凝胶保水性；儿茶素使凝胶束缚水的能力降低，而加入亚麻籽胶后，可提高凝胶束缚水的能力；亚麻籽胶添加量越高，最终形成凝胶的储能模量G’越大，凝胶弹性越好；加入亚麻籽胶后，凝胶中的α-螺旋含量增加，而β-折叠、β-转角和无规卷曲含量均降低。因此，不同含量的亚麻籽胶可改善儿茶素对凝胶特性的不利影响。