多指标正交试验优选莲房黄酮苷的提取工艺

吴岩斌 ，吴晗禹 ，郑淑霞 ，易 骏 ，吴建国 ，吴锦忠

（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建教育学院理科部，福建 福州 350001）

莲房（Nelumbinis Receptaculum）为睡莲科植物莲（Nelumbium nuciferum Gaertn.）的干燥成熟花托，又名莲蓬壳，性温，味苦涩，归肝经，具有消瘀、止血等功效［1］。我国莲资源十分丰富，主要分布于长江、黄河和珠江三大流域［2］。药理研究发现，莲房具有抗氧化、抗辐射、抗肿瘤、抗衰老、抗心肌缺血、保肝和保护心血管等作用［3-8］。莲房中含有金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷等十几个黄酮类成分［9-11］，目前研究报道的莲房黄酮类化合物的提取方法主要是以总黄酮的提取率为评价指标进行研究，其含量测定多以芦丁为指标，采用紫外-可见分光光度法进行测定［12－13］，具有一定的局限性，而同时以多个黄酮苷类化合物含量为指标的提取工艺研究还未见报道。因此，本实验以莲房中8个黄酮苷：杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、丁香亭-3-O-β-D-葡萄糖苷的总含量为考察指标来筛选莲房药材中黄酮类化合物的最佳提取方法，以期为莲房黄酮类成分的开发利用提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津）；AR223CN电子天平［奥豪斯仪器（上海）有限公司］；HH-S型水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）；DLSB-5L／20低温冷却液循环泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；LK-1000A摇摆式中药粉碎机（上海隆拓仪器设备有限公司）。

1.2 试药 莲房采自福建南平建瓯，经福建中医药大学药学院吴锦忠教授鉴定为睡莲科植物莲（N.nuciferum Gaertn.）的干燥成熟花托。金丝桃苷、异槲皮苷、杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、异鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷、丁香亭-3-O-β-D-葡萄糖苷为实验室自制，含量大于98%；山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷（成都曼思特生物科技有限公司，批号：13041911）；山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（上海纯优生物科技有限公司，批号：12011402）；乙腈（美国默克公司）为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 供试品溶液的制备 将莲房药材粉碎，精密称取莲房粉末1 g，用70%乙醇1∶12回流提取2次，每次2 h，滤过，合并滤液，将滤液浓缩后，用50 mL容量瓶定容，过0.22 μm滤膜，即得供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取五氧化二磷减压干燥24 h的杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（3.30 mg）、金丝桃苷（4.5 mg）、异槲皮苷（4.5 mg）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（5.00 mg）、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷（2.5 mg）、异鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷（2.89 mg）、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（3.55 mg）、丁香亭-3-O-β-D-葡萄糖苷（5.70 mg），分别置于 5 mL的量瓶中，用50%的甲醇超声溶解后定容，分别制成杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 0.66 mg／mL、金丝桃苷 0.90 mg／mL、异槲皮苷 0.90 mg／mL、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 1.00 mg／mL、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷0.50 mg／mL、异鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷 0.587 mg／mL、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 0.71 mg／mL、丁香亭-3-O-β-D-葡萄糖苷1.14 mg／mL的对照品溶液。

2.3 色谱条件 色谱柱C18柱（YMC-Pack ODS-A，5 μm，4.6 nm×250 nm），检测波长为 360 nm，柱温30 ℃，进样量 20 μL，流速 0.8 mL／min。 以乙腈－0.1%乙酸为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1。在上述色谱条件下，混合对照品和莲房供试品HPLC色谱图见图 1。

2.4 标准曲线的制备 将8个黄酮苷对照品溶液，稀释成不同的浓度，杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（2.63、5.26、10.53、21.05、42.10 μg／mL）、金丝桃苷（7.03、14.06、28.13、56.25、114.66 μg／mL）、异槲皮苷（1.93、3.87、7.73、15.47、30.93 μg／mL）、槲皮 素 -3-O-β-D- 葡 萄 糖 醛 酸 苷 （32.33、64.67、129.33、258.67、517.33 μg／mL）、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷（1.02、2.05、4.10、8.21、32.82 μg／mL）、异鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷（2.82、5.65、11.30、22.60、45.19 μg／mL）、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（1.41～22.50 μg／mL）、丁香亭-3-O-β-D-葡萄糖苷（4.59、9.18、18.37、36.73、73.47 μg／mL），按照“2.3”项的色谱条件进行进样，记录8个黄酮苷的峰面积。以质量浓度（μg／mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、山柰酚-3-O-β-D-半乳糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、丁香亭-3-O-β-D-葡萄糖苷的回归方程分别为Y＝18 882X－18 125，r＝0.999 5；Y＝48 725X＋5 950，r＝0.999 9；Y＝40 997X＋2 243.7，r＝0.999 9；Y＝6 771.6X－18 951，r＝0.999 9；Y＝24 565X＋6 664，r＝0.999 9；Y＝28 410 X－6 112.9，r＝0.999 3；Y＝33 516X＋15 280，r＝0.999 7；Y＝7 082X＋5 040.6，r＝0.999 9；杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、丁香亭-3-O-β-D-葡萄糖苷分别在2.63～42.10、7.03～114.66、1.93～30.93、32.33～517.33、1.02～32.82、2.82～45.19、1.41～22.50、4.59～73.47 μg／mL呈良好的线性关系。

表1 梯度洗脱程序

图1 混合对照品（A）和莲房供试品（B）的HPLC色谱图

2.5 样品含量测定 供试品溶液和回流提取工艺的各样品溶液，按照“2.3”项的色谱条件进行进样，计算8个黄酮苷的峰面积和含量。

2.6 回流提取工艺的研究

2.6.1 提取溶剂的选择 由于黄酮类化合物在醇水系统中具有较高的溶解性，乙醇是常用溶媒，具有安全性高、适宜工业化生产、价格便宜等特点，故选用不同体积分数的乙醇筛选溶媒，采用常用的回流提取方法进行考察。精密称取莲房药材粉末1.0 g，分别用16倍量水和30%、50%、70%、95%乙醇回流提取1.5 h，过滤得滤液，定容至50 mL，HPLC分析不同提取液中8种黄酮苷成分的量。结果显示，30%、50%、70%乙醇提取得到提取液中8个黄酮苷成分含量较高，因此将 30%、50%、70%乙醇作为下 一步提取工艺优化的选用溶剂，见表2。

表2 不同体积分数乙醇对莲房提取液中黄酮苷含量的影响

2.6.2 提取工艺的优化 应用正交试验优化莲房黄酮类成分的提取方法。如表2所示，考察乙醇体积分数、提取时间、提取次数和溶剂用量对黄酮类成分提取效率的影响，每个因素设3个水平，采用四因素三水平L9（34）表（见表3）进行正交试验。精密称取莲房粉末1.0 g，按照正交试验方案进行提取，提取液浓缩过后，定容至50 mL，以HPLC法测定莲房中8个黄酮苷的含量，并进行正交试验分析，正交实验分析结果如表4。从极差分析可知各因素对莲房黄酮苷提取效率的影响主次顺序为：溶剂用量＞提取次数＞乙醇体积分数＞提取时间。方差分析结果表明乙醇体积分数、提取时间、提取次数和溶剂用量莲房提取液中黄酮苷成分的含量均有影响，但差异无统计学意义，见表5。根据上述结果确定莲房黄酮苷类成分的最佳提取方法为16倍量70%乙醇回流提取3次，每次1 h。

表3 正交试验因素水平表

表4 正交试验方案和结果

2.6.3 提取工艺的验证 为进一步考察上述最佳工艺条件的稳定性和合理性，分别称取莲房粉末3份，按上述最佳提取条件提取。结果显示，3批莲房中8个黄酮苷的平均总含量为分别为1.91%、1.91%、1.95%，RSD为1.08%，表明该回流提取工艺稳定、可重复。

3 讨 论

本研究采用正交试验，用乙醇回流提取法，以HPLC法测定的8个黄酮苷的量为检测指标，对莲房黄酮类成分的提取方法进行优化。本实验比较了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%乙酸水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%乙酸水梯度洗脱系统对莲房黄酮类成分的影响，结果发现乙腈-0.1%乙酸水梯度洗脱时，8种黄酮类化合物可以达到完全分离。

表5 方差分析

实验设计中，为了安排尽可能多的影响因素，采用四因素三水平无空白列的正交试验。在乙醇体积分数、提取时间、提取次数和溶剂用量4个因素中，尽管提取次数和溶剂用量间存在交互作用，但可通过极差分析和重复设置试验结果的方差分析确定各因素影响作用的大小和显著性。正交试验结果表明，乙醇体积分数、提取时间、提取次数和溶剂用量对莲房提取液中黄酮苷的含量均有影响，但差异均无统计学意义。通过方差分析比较，发现各考察因素对莲房提取液中黄酮苷的含量的影响主次顺序为：溶剂用量＞提取次数＞乙醇体积分数＞提取时间，最佳提取工艺为A3B3C1D3，即16倍量70%乙醇回流提取3次，每次1 h，验证试验结果表明该方法稳定、可重复。

HPLC法能准确测定药材中具体的黄酮类化合物的含量，化学研究表明，莲房中含有多种黄酮类成分，本实验采用多指标成分正交试验优选莲房黄酮类化合物的提取方法，与以单一成分或总类成分为指标相比，能够更全面准确评价莲房黄酮类化合物的提取方法，为莲房药材研究中样品处理过程提供了更全面、科学的方法。