酱油渣中乳酸菌的分离鉴定及其生长特性研究

唐素婷，区锡敏，孙张乐，黄桂东，娄华，钟先锋，*

（1.佛山科学技术学院食品科学与工程学院，广东佛山528231；2.广东省传统发酵食品工程技术研究中心，广东佛山528231；3.广东省食品流通安全控制工程技术研究中心，广东佛山528231；4.佛山市酿造工程技术研究中心，广东佛山528231；5.佛山农业生物制造工程技术研究中心，广东佛山528231；6.佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东佛山528231）

酱油渣，又称为酱渣，是指酱油制作过程中产生的残渣。据统计，2016年我国酱油产量达 1 000 万吨[1-2]，按照酱油与酱油渣1 ∶0.67 的产出比例，酱油渣年产量接近700 万吨。由于酱油渣水分含量高，不易贮存，如不及时处理，会造成环境极大负担[3]。酱油渣富含粗蛋白[4-5]、粗纤维[6-7]、粗脂肪等物质[8-10]，用作饲料是其综合利用的主要途径之一[11]，但是酱油渣含盐量高，过量喂养容易导致动物中毒，加之其富含粗纤维，适口性较差，导致酱油渣饲料化应用受到一定程度的制约。利用特定的微生物再次发酵酱油渣，能够提高其营养价值以及改善其理化性质，可有效解决上述问题。酱油渣的主要微生物涉及曲霉、酵母菌及乳酸菌三大类[12-13]。乳酸菌能分解糖类物质，产生乙酸、乳酸等有机酸，通过降低pH 值，抑制腐败菌的生长[14-15]，增加酱油渣发酵产物的营养物质含量。范志平等[16]对乳酸菌、巨大芽孢杆菌、醋酸菌和黑曲霉的菌株混合发酵酱油渣、秸秆等废弃资源进行了研究，发现乳酸菌代谢产生的乳酸，能够将难溶性磷螯合生成可溶性磷盐，有效地增加原料中的磷含量。王红涛[17]研究证明，以源于酱油渣的乳酸菌和地衣芽孢杆菌发酵酱油渣，发酵后的饲料粗脂肪含量降低，粗蛋白含量有所提高，饲料品质更高。目前，乳酸菌在饲料行业中的应用受到较多关注，但从酱油渣中分离乳酸菌应用于酱油渣发酵的研究则很少。本研究拟采用传统的微生物培养手段从酱油渣中分离乳酸菌菌株，使用形态学、生理生化特征试验和分子生物学结合的手段对其进行鉴定，并测定其生长曲线，以期为其应用于酱油渣发酵、改善酱油渣发酵品质提供菌种资源，为酱油渣饲料化提供理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

酱油渣样品：由广东省某调味食品有限公司提供。

过氧化氢生化鉴定管、革兰氏染色试剂盒、硫化氢生化鉴定管、吲哚生化鉴定管、明胶生化鉴定管、硝酸盐（还原）生化鉴定管：广东环凯微生物科技有限公司；琼脂粉：北京奥博星生物技术有限责任公司；MRS培养基（改良MRS 培养基基础）：广东环凯微生物科技有限公司；碳酸钙、氯化钠、氢氧化钠：天津市大茂化学试剂厂。

1.2 设备与仪器

电子分析天平（ME104）：梅特勒-托利多精密仪器公司；超净工作台（SW-CJ-1FD）：苏州安泰空气技术有限公司；恒温培养箱（LRH-150）：上海一恒科学仪器有限公司；全自动灭菌锅（GR60DA）：致微（厦门）仪器有限公司；防冻霜冰箱（BCD-189WDPV）：海尔股份有限公司；显微镜（PH100）：凤凰光学集团有限公司；微孔板分光光度计酶标仪（Epoch2）：美国伯腾仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酱油渣中乳酸菌的分离纯化

无菌条件下，称取酱油渣25 g 溶解于225 g 无菌磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline），涡旋仪上振荡1 min，静置30 min，吸取中层溶液，梯度稀释法制成10-1至10-7共7 个浓度的稀释液[18]。吸取各稀释度溶液100 μL，使用无菌玻璃珠均匀涂布于含0.3%碳酸钙的MRS 固体培养基，于37 ℃培养箱倒置培养24 h。挑取MRS 培养基中有典型溶钙圈的菌落划线于相应固体培养基，反复划线纯化至菌落一致[19]。挑取单菌落于 MRS 液体培养基中 37 ℃培养 12 h，与甘油 1 ∶1（体积比）混合保存于-20 ℃冰箱备用。同时划线于MRS固体斜面培养基，37 ℃培养24 h～36 h 至长出菌落，4 ℃冰箱保藏备用。

1.3.2 酱油渣中乳酸菌的鉴定

菌株的形态学观察：将已纯化的菌株划线于固体培养基中，37 ℃培养24 h，观察并记录菌株的菌落形态。取菌株的菌落进行革兰氏染色实验，在显微镜下观察菌株的菌体形态[20]。

菌株的生理生化实验：参照《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[21]和华鹤良[22]的方法，杆状菌株进行酶触、硝酸盐（还原）、明胶液化、硫化氢和吲哚试验；球状菌株进行酶触、硝酸盐（还原）、葡萄糖产气试验、6.5%NaCl 生长以及10、45 ℃生长试验。具体实验操作参考生化鉴定管的说明书。

乳酸菌株的分子生物学鉴定：将革兰氏阳性的菌株活化2 次至稳定期，低温条件下送1 mL 菌液至北京六合华大基因科技有限公司进行菌株的DNA 提取、PCR 扩增及16S rRNA 序列测序。

系统发育树的构建：根据菌株的测序序列，登陆GenBank 中 BLAST 程序（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）比对，在EzBioCloud 查询模式菌株信息[23]，整合建树所需16S rRNA 信息，利用Mega5.0 软件，采用邻近算法，自展值（bootstrap 值）为 1 000 构建系统发育树[24]。

1.3.3 乳酸菌菌株生长曲线的测定

菌株活化三代至稳定期，调节OD600nm=1±0.05，按照2%的接种量接种于MRS 液体培养基，以不接种的MRS 液体培养基为阴性对照，37 ℃条件下培养至0、2、4、6、8、10、12、16、20，24、28、32、36、40 h，分别取出培养试管，利用酶标仪测定乳酸菌株的OD600nm值。以OD600nm值为纵坐标，培养时间为横坐标绘制各菌株生长曲线[25]。

2 结果与分析

2.1 酱油渣中乳酸菌的菌落形态和生理生化试验特征

本研究从酱油渣中分得到4 株乳酸菌，分别是HT4、HT102、HT160、HT197，菌落颜色为灰白或奶白色，中央凸起，菌落表面光滑有光泽，边缘齐整。酱油渣中乳酸菌的菌落形态描述详见表1。

表1 酱油渣中乳酸菌分离菌株菌落形态及其在显微镜下的菌体形态Table 1 The colony morphology and microscopic morphology of lactic acid bacteria isolated from soy sauce residue

部分乳酸菌菌体形态见图1。

图1 部分菌株在显微镜下的菌体形态（1 000 倍）Fig.1 Microscopic morphology under microscope of partial strains（1 000 times）

由表1 和图1 知，经革兰氏染色试验后镜检发现，4 株乳酸菌均为革兰氏阳性菌，菌体颜色为深紫色，无芽孢且不运动。其中菌株HT4、HT102 菌体为小球状，成对或呈短链排列；菌株HT160、HT197 菌体为中长杆状，单在、成对或呈短链状分布。

参照华鹤良[22]的方法，利用生理生化试验对4 株乳酸菌菌株的属进行初步鉴定。菌株HT4、HT102 和菌株HT160、HT197 的生理生化结果详见表2 和表3。

由表2 可知，菌株 HT4、HT102 在酶触、硝酸盐还原、葡萄糖产气、6.5%NaCl 生长、10 ℃和45 ℃生长试验等项目均呈阴性，参照《乳酸细菌，基础、技术和应用》[26]，结合形态学结果及生理生化试验结果，将菌株HT4、HT102 初步鉴定为乳酸乳球菌属（Lactococcus）。由表3 可知，菌株 HT160、HT197 的酶触、硝酸盐还原、明胶液化、H2S 产生以及吲哚试验等项目均呈阴性，参照《乳酸细菌，基础、技术和应用》[26]，结合菌株HT160、HT197 的形态学结果及生理生化试验结果，将菌株HT160、HT197 初步鉴定为乳酸乳杆菌属（Lactobacillus）。

表2 酱油渣中球状菌株生理生化鉴定结果Table 2 Phenotypic characteristics of spherical strains in soy sauce residue

表3 酱油渣中球状菌株生理生化鉴定结果Table 3 Phenotypic characteristics of bacular strains in soy sauce residue

2.2 菌株的分子生物学鉴定结果

将4 株乳酸菌活化三代后，低温条件下送往北京六合华大基因科技有限公司进行基因组提取，16S rRNA 基因的聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），并对扩增的产物进行琼脂凝胶电泳（电泳条件：3 μL 样品+1%琼脂糖凝胶，使用Trans 2K@Plus DNA Marker。），凝胶电泳图详见图2。

图2 四株乳酸菌16S rRNA PCR 扩增产物电泳图Fig.2 Electrophoresis of 16S rRNA amplified products of 4 lactic acid bacteria

由图2 得知，4 株乳酸菌16S rRNA 基因的 PCR扩增产物大小均在1 500 bp 左右，且电泳带光亮明显，证明PCR 产物无杂质可进行测序[27-28]。

得到菌株的16S rRNA 序列后，在NCBI 中Blast程序上进行比对，比对结果详见表4。

表4 酱油渣中分离菌株的16S rRNA 序列同源性比对结果Table 4 Results of 16S rRNAsequence homology analysis of isolates from soy sauce residue

汇总模式菌株及4 株乳酸菌16S rRNA 序列，使用Mega5.0 进行发育树的构建，得到乳球菌发育树见图3 以及乳杆菌发育树见图4。

图3 乳酸球菌16S rRNA 基因序列系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequence of Lactococcus

图4 乳酸杆菌16S rRNA 基因序列系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequence of Lactobacillus

由图3 可知，HT4、HT102 与 Lactococcuslactis subsp.lactisJCM 5805T（Genbank 登录号：BALX01000047）同一分支，且同源性均达99%以上，将HT4、HT102 鉴定为乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）；结合表4 中NCBI比对的结果，将菌株HT4 鉴定为乳酸乳球菌霍氏亚种（Lactococcuslactis subsp.hordniae），将菌株 HT102 鉴定为乳酸乳球菌乳亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis）。

由图 4 可知，HT160、HT197 与 Lactobacillus paracasei subsp.paracaseiATCC 25302T（Genbank 登录号：ACGY01000162）处于同一分支，同源性均在99%以上，将其鉴定为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）。结合表4 中 HT160、HT197 的 NCBI 比对结果，将菌株HT160 鉴定为副干酪乳杆菌坚韧亚种（Lactobacillus paracasei subsp.tolerans），将菌株HT197 鉴定为副干酪乳杆菌副干酪亚种（Lactobacillus paracasei subsp.paracasei）。

胡传旺[14]研究酱油发酵过程的微生物的变化规律，研究发现酱油发酵过程的微生物有Lactobacillus（乳杆菌）、Weissella（魏斯氏菌）、Pediococcus（片球菌）、Staphylococcus（葡萄球菌）、Bacillus（芽孢杆菌）五大类。Ansah[29]对酱油微生物进行研究，还发现与酱油发酵相关的乳酸菌除嗜盐四联球菌[30-31]，还有乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）及嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）等。本研究结果与前人研究结果相符。

2.3 乳酸菌的生长曲线测定

4 株乳酸菌在37 ℃条件下的生长曲线如图5所示。

图5 乳酸菌的生长曲线Fig.5 Growth curves of 4 isolated strains

由图5 可知，4 株乳酸菌在37 ℃的生长情况基本相似，随着培养时间的延长，4 株乳酸菌的OD600nm在接种 0～3 h，OD600nm增长缓慢；在 3 h～12 h，OD600nm呈指数增加；12 h 时，OD600nm均达1.300 左右，菌株生长进入稳定期；菌株 HT102、HT160 在接种 28 h 后 OD600nm达到最大值，分别为 1.600、1.556；菌株 HT4、HT197 在培养 32 h 后的 OD600nm达到最大值，分别为 1.556、1.576。4 株乳酸菌的生长强度由强到弱排序为：HT102（乳酸乳球菌乳亚种）＞HT197（副干酪乳杆菌副干酪亚种）＞HT160（副干酪乳杆菌坚韧亚种）＞HT4（乳酸乳球菌霍氏亚种）。

3 结论

本研究从酱油渣中分离得到4 株乳酸菌，分别命名为 HT4、HT102、HT160、HT197。利用形态学、生理生化特征试验及分子生物学手段对其进行鉴定，结合NCBI 比对结果及系统发育树的构建，4 株乳酸菌分属于两个属、两个种及四个亚种，将菌株HT4 确定为乳酸乳球菌霍氏亚种（Lactococcuslactis subsp.hordniae），菌株HT102 确定为乳酸乳球菌乳亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis），菌株HT160 确定为副干酪乳杆菌坚韧亚种（Lactobacillus paracasei subsp.tolerans），菌株HT197 确定为副干酪乳杆菌副干酪亚种（Lactobacillus paracasei subsp.paracasei）。本研究还测定了 HT4、HT102、HT160、HT197 的生长曲线，37 ℃下恒温培养，4 株乳酸菌在接种30 h 左右OD600nm达到最大值，分别为 1.524、1.600、1.556、1.576，在 37 ℃条件下培养，4 株乳酸菌菌株的生长强度由大到小依次为HT102、HT197、HT160、HT4。本研究通过分离、纯化酱油渣中的乳酸菌，为进一步研究乳酸菌的益生特性奠定基础，为酱油渣的发酵品质、综合利用提供菌种资源和参考依据。