酸杨桃罗汉果复合饮料抗氧化活性及稳定性研究

戴梓茹，梁冬萍，秦海琼，张晨晓，王培

（1.广西北部湾海洋生物多样性养护重点实验室，广西钦州535011；2.广西高校北部湾特色海产品资源开发与高值化利用重点实验室，广西钦州535011；3.钦州学院食品工程学院，广西钦州535011）

酸杨桃是中国南方特色水果，营养丰富，具有促进消化、保肝护脏、预防“三高”、抗氧化等多种生理活性作用，但其口感偏酸，带刺激性，不宜鲜食[1-4]。罗汉果是药、食两用的材料，甜度高，具有抗氧化、清肺润肠、护肤、降血糖、降血脂等功效[5-6]。酸杨桃饮料中加入甜度较高的罗汉果调配，对饮料口感和功能性均有提升作用。研究采用DPPH 自由基清除能力（DPPH法）和氧自由基吸收能力（oxgen radical absorbance capacity，ORAC 法）研究酸杨桃罗汉果复合饮料的抗氧化活性，探讨温度、pH 值、紫外线和NaCl 等因素对复合饮料的抗氧化稳定性影响，并通过模拟胃肠道消化，初步探讨其在体内的抗氧化活性变化规律，为饮料加工及推广应用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酸杨桃罗汉果复合饮料：广西高校北部湾特色海产品资源开发与高值化利用重点实验室；磷酸盐缓冲液：Solar science 公司；自由基产生剂 2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐[2，2′-Azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，AAPH]、荧 光 物 质（Fluorescein sodium salt，FL）、抗氧化标准物质水溶性维生素 E（Trolox）、DPPH 自由基、胰蛋白酶[BR，1 ∶250（g/g）]、胃蛋白酶（456 000 U/g）：Sigma 公司；95%乙醇：成都市科龙化工试剂厂。

1.2 主要仪器

H-4 恒温水浴锅：金坛市天瑞仪器有限公司；TGL20 台式高速冷冻离心机：长沙英泰仪器有限公司；1510 酶标仪：Thermo Fisher Scientific 公司。

1.3 方法

1.3.1 酸杨桃罗汉果复合饮料制备

根据北部湾大学食品工程学院海洋资源开发与利用课题组的配方优化结果，酸杨桃罗汉果复合饮料以9.0%酸杨桃原汁、4.0%罗汉果浸提液、0.03%阿斯巴甜、0.05%食盐调配而成。

1.3.2 酸杨桃罗汉果复合饮料体外抗氧化活性

1.3.2.1 氧自由基吸收能力（ORAC 试验）

ORAC 法测定氧化自由基吸收能力参考Huang 等方法[7]稍作修改。

将酸杨桃罗汉果复合饮料原液用磷酸盐缓冲液稀释制成10 倍作为样品待测液。在黑色96 孔板内加入 20 μL 磷酸盐缓冲液作为空白，20 μL Trolox 标准溶液（3.125 μmol/L～50 μmol/L），20 μL 样品待测液，再加入 200 μL AAPH 溶液，振板 1 min，并将板置于 37 ℃培养箱中避光孵育30 min，最后加入0.1 mmol/L 的20 μL APPH 溶液，在485 nm 激发波长，535 nm 发射波长下进行连续测定荧光强度，整个体系保持37 ℃，每2 min测定一次荧光强度，测定时间设定在荧光衰退呈基线后为止，约2.5 h。根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力，结果用微摩尔水溶性维生素E（Trolox）当量/每升样品原液来表示（μmol TE/L）。

1.3.2.2 DPPH 自由基清除能力

DPPH 法采用Bao 等的方法[8]并稍作修改。

将酸杨桃罗汉果复合饮料原液用磷酸盐缓冲液稀释制成10 倍作为样品待测液。在白色96 孔板内加入Trolox 标准液（3.125 μmol/L～50 μmol/L）和 20 μL 样品，在加入 200 μL 乙醇和 200 μL DPPH 溶液（0.1 mmol/L），轻轻摇匀，25 ℃，避光反应30 min，在 517 nm 波长下测定吸光值，根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力，结果用微摩尔水溶性维生素E[Trolox 当量/每升样品原液来表示（μmol TE/L）]。

1.3.3 酸杨桃罗汉果复合饮料稳定性分析

根据氧自由基吸收能力（ORAC 试验）和DPPH 自由基清除能力试验结果数据，用磷酸盐缓冲液稀释酸杨桃罗汉果复合饮料为10 倍的样品待测液250 mL，用于稳定性试验。

1.3.3.1 温度对酸杨桃罗汉果复合饮料稳定性的影响

各取样品液 4 mL，分别在 20、40、60、80、100 ℃下处理1 h，取出放冰上冷却，分别进行ORAC 和DPPH试验。

1.3.3.2 pH 值对酸杨桃罗汉果复合饮料稳定性的影响

各取样品液4 mL，用1 mol/L HCl 或1 mol/L NaOH将 pH 值分别调整至 2、4、6、8、10，在 25 ℃ 静置保持1 h，分别进行 ORAC 和 DPPH 试验。

1.3.3.3 紫外线对酸杨桃罗汉果复合饮料稳定性的影响

各取样品液4 mL，在紫外灯下分别照射时长为15、30、45、60、75、90、105、120 min，分别进行 ORAC 和DPPH 试验。

1.3.3.4 NaCl 对酸杨桃复合饮罗汉果料稳定性的影响

各取样品液 4 mL，分别加入 2 mL 浓度为 1、2、3、4、5 mmol/L 的NaCl 溶液，充分混匀放置15 min，分别进行 ORAC 和 DPPH 试验。

1.3.4.5 体外模拟胃肠道消化

用磷酸盐缓冲液配制稀释度为10 倍的酸杨桃罗汉果复合饮料样品液100 mL，取10 mL，记为未处理液A。然后用1 mol/L HCl 调节pH 值至2.0，加入胃蛋白酶 1 mg（20 mg/g），37 ℃恒温水浴 90 min。用 1 mol/L NaOH 调节pH 值至7.5，收集一半反应液，记为消化液B，冷却至25 ℃，备用。向另一半反应液中加入胰蛋白酶 2 mg（40 mg/g），37 ℃恒温水浴 120 min，90 ℃水浴15 min，灭酶，此反应液记为消化液C，冷却至25 ℃，备用。

分别将未处理液A、消化液B 和消化液C，进行ORAC 和 DPPH 试验。

2 结果与分析

2.1 酸杨桃罗汉果复合饮料体外抗氧化活性研究

2.1.1 氧自由基吸收能力

以维生素E 浓度为横坐标，荧光曲线为纵坐标，绘制出维生素E（Trolox）系列浓度标准溶液标准曲线，如图1 所示。

图1 维生素E 系列浓度标准曲线Fig.1 Standard solution of concentration of Trolox series

该标准曲线y=2.522 4x+3.563 7，相关系数R2=0.998 1。通过Trolox 标准曲线方程计算得知复合饮料的 ORAC 值为 335.61 μmol TE/L。

2.1.2 DPPH 自由基清除能力

以Trolox 标准品浓度作为横坐标，清除自由基能力为纵坐标，绘制出Trolox 系列标准溶液的DPPH 自由基清除率的标准曲线，如图2。

该标准曲线为y=0.013 7x+0.175 7，R2=0.990 3。通过标准曲线方程换算得出复合饮料的DPPH 值为113.96 μmol TE/L。

图2 Trolox 标准溶液DPPH 自由基清除率曲线Fig.2 Curve of DPPH free radical scavenging rate of Trolox standard solution

2.2 酸杨桃罗汉果复合饮料稳定性分析

2.2.1 温度对酸杨桃罗汉果复合饮料稳定性的影响

温度对酸杨桃罗汉果复合饮料稳定性的影响见图3。

图3 温度对酸杨桃罗汉果复合饮料稳定性的影响Fig.3 Effect of temperature on the stability of compound beverage with carambola and momordica fruit

如图3 所示，复合饮料分别在 20、40、60、80、100 ℃条件下加热处理后，与未处理组相比（DPPH 113.96 mol TE/L，ORAC 335.61 mol TE/L），酸杨桃罗汉果复合饮料ORAC 值和DPPH 值无显著差异。酸杨桃罗汉果复合饮料中的抗氧化成分有酸杨桃黄酮、多酚[3-4]及罗汉果黄酮、皂甙、多糖[9-10]等物质。乔建卫等的研究表明黄芩黄酮类物质具有良好的热稳定性[11]，胡迎芬等研究发现在40 ℃～100 ℃的温度范围内对紫叶李提取物加热处理，对其抗氧化活性无显著影响[12]，这与试验结果一致，说明不同温度加热处理的条件下，复合饮料抗氧化活性较为稳定。

2.2.2 pH 值对酸杨桃罗汉果复合饮料稳定性的影响

pH 值对酸杨桃罗汉果复合饮料稳定性的影响见图4。

pH 值对酸杨桃罗汉果复合饮料稳定性的影响如图4 所示（未调复合饮料pH 值为5.6），随着pH 值的增大，酸杨桃罗汉果复合饮料抗氧化活性呈现先增大后降低的趋势，pH 值为 8.0 时，ORAC 值最大，pH 值为6.0 时，DPPH 值最大。陈建中等研究发现碱性条件下茼蒿总黄酮的抗氧化活性显著降低[13]，何莉萍等研究表明荷叶总黄酮在pH 6.0 左右较稳定[14]。酸杨桃罗汉果复合饮料抗氧化活性在中性条件下较稳定，可能是饮料中起抗氧化活性的酚羟基在酸性或碱性条件下遭到破坏而导致抗氧化能力减弱。

图4 pH 值对酸杨桃罗汉果复合饮料稳定性的影响Fig.4 Effect of pH on the stability of compound beverage with carambola and momordica fruit

2.2.3 紫外线对酸杨桃罗汉果复合饮料稳定性的影响

紫外线照射时间对酸杨桃罗汉果复合饮料稳定性的影响见图5。

图5 紫外线照射时间对酸杨桃罗汉果复合饮料稳定性的影响Fig.5 Effect of ultraviolet irradiation time on the stability of compound beverage with carambola and momordica fruit

紫外线对酸杨桃罗汉果复合饮料稳定性的影响如图5 所示，与未处理组相比（DPPH 113.96 mol TE/L，ORAC 335.61mol TE/L），紫外线照射时间小于45 min时，酸杨桃罗汉果复合饮料抗氧化能力较稳定，随着照射时间延长，ORAC 和DPPH 值均有下降趋势。研究表明，光照条件下多糖、黄酮类物质抗氧化能力均有不同程度的减弱[11，15]，这与试验结果相似，因此在饮料的加工及贮藏过程中应尽量避免强烈而长时间的光照，以保证其抗氧化活性。

2.2.4 NaCl 对酸杨桃罗汉果复合饮料稳定性的影响

氯化钠对酸杨桃罗汉果复合饮料稳定性的影响见图6。

氯化钠对酸杨桃罗汉果复合饮料稳定性的影响如图6 所示，经不同浓度NaCl 溶液处理后，酸杨桃罗汉果复合饮料ORAC 和DPPH 值没有显著变化，这与孟良玉、何莉萍等的研究结果相似[14-15]，说明Na+处理后复合饮料抗氧化活性比较稳定。

图6 氯化钠对酸杨桃罗汉果复合饮料稳定性的影响Fig.6 Effect of NaCl on the stability of compound beverage with carambola and momordica fruit

2.2.5 体外模拟胃肠道消化

体外模拟胃肠道消化对对酸杨桃罗汉果复合饮料稳定性的影响见图7。

图7 体外模拟胃肠道消化对对酸杨桃罗汉果复合饮料稳定性的影响Fig.7 Effect of gastrointestinal digestion in vitro on the stability of compound beverage with carambola and momordica fruit

体外模拟胃肠道消化对稳定性的影响如图7 所示，在外模拟胃肠道消化对酸杨桃罗汉果复合饮料抗氧化活性有显著影响。ORAC 值呈现略微下降的趋势，DPPH 自由基清除能力表现为先下降后上升，总体而言，随着模拟消化的进行，酸杨桃罗汉果复合饮料的总体抗氧化活性具有较强的抗胃肠道消化能力，其抗氧化能力相对稳定。

3 结论

对酸杨桃罗汉果复合饮料总抗氧化能力及稳定性研究表明，酸杨桃罗汉果复合饮料具有较强的抗氧化能力，ORAC 值和 DPPH 值分别为 335.61 μmol TE/L和113.96 μmol TE/L；温度和NaCl 值的变化，对酸杨桃罗汉果复合饮料稳定性没有显著性影响；pH 值和紫外线照射时间改变，对复合饮料抗氧化活性有显著影响，在 pH 值为 6～8、紫外照射时间<45 min 时，ORAC值和DPPH 值没有明显变化，复合饮料抗氧化活性较高；胃肠道消化导致ORAC 值和DPPH 值显著下降，但仍具有较强的抗氧化能力。