pH渐变条件下双酶分步酶解的猪皮胶原肽的体内外抗氧化活性研究

张康华，姜珊，高鹏，代龙

（山东中医药大学药学院，山东济南250355）

猪皮中胶原蛋白含量达到29%[1]，通过酶解猪皮胶原蛋白可得到具有多种生理活性的肽，其中抗氧化活性肽由于安全、高效等特点，被用于食品及化妆品中[2-3]。因此进行猪皮胶原肽抗氧化性的研究具有重要的现实意义。从猪皮中提取胶原蛋白的方法包括碱提取、酸提取、酶解提取、热水提取[4-6]，其中仿生酶解应用较广，提取效果较优，但工艺复杂，因加入了酸碱调节pH 值，后期需要除盐易造成肽损失，且成本较高，因此本研究采用碱性蛋白酶及菠萝蛋白酶在没有外加酸碱调节pH 的条件下对猪皮进行酶解，根据参考文献[7-14]及本实验室前期优化的酶解条件进行提取，然后对其进行超滤分离纯化，得到不同分子量的胶原肽酶解液，再将上述各组分进行体内外抗氧化活性实验，考察其抗氧化能力。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

新鲜猪皮：购于龙大肉食店；碱性蛋白酶（2 000 U/mg）、菠萝蛋白酶（2 000 U/mg）：上海佛森生物科技有限公司；牛血清白蛋白（LOT：Y13S9S70264）：上海源叶生物科技有限公司；2，2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH，LOT：C10430696）、2，2’-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸） 二铵盐（ABTS，LOT：C10144809）：上海麦克林生化科技有限公司；谷胱甘肽（LOT：D1711070）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；小白鼠雌雄各半：山东中医药大学动物实验中心；微量丙二醛（MDA）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPX）试剂盒、总超氧化物歧化酶（T-SOD）试剂盒、总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒、过氧化氢酶（CAT）试剂盒：上海信帆生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与型号

卷式超滤膜（1 kDa、3 kDa）：北京市旭邦膜设备有限责任公司；FA2204B 万分之一电子天平：上海佑科仪器仪表有限公司；BT300-2J 蠕动泵：保定兰格恒流泵有限公司；真空冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；HH-S4 数显恒温水浴锅：常州国宇仪器制造有限公司；UV-1800 紫外可见分光光度计：岛津仪器有限公司；电渗析器：沧州市众邦水处理技术有限公司；高速离心机：上海精密仪器有限公司。

2 方法

2.1 各分子量猪皮胶原肽的制备

取鲜猪皮，刮去皮下杂质，以剪刀剪成厚度小于2 mm、长度小于2 cm 的碎块，用5 倍量0.3%氢氧化钠溶液浸泡8 h，滤去碱液，水洗至近中性，匀浆5 min，加8 倍量水加热煮沸15 min，待冷至约55 ℃，加入1 %碱性蛋白酶，置旋转蒸发器中，55 ℃保温酶解1 h（60 r/min），再加入1 %菠萝蛋白酶，55 ℃保温酶解3 h（60 r/min），酶解液加热煮沸15 min，过滤，滤液放冰箱中冷藏12 h，离心，取上清液减压浓缩（60 ℃～65 ℃，-0.07 MPa～-0.08 MPa）至相对密度为 1.10～1.15（60 ℃），冷冻干燥（-47 ℃，15 Pa）后即得猪皮酶解原液冻干粉。取适量冻干粉溶于水，先后用不同分子截留量（3、1 kDa）的超滤膜进行分离，分别得到M＞3 kDa 组分、1 kDa＜M＜3 kDa 组分、M ＜1 kDa 组分。

2.2 各组分胶原蛋白肽含量指标测定

采用福林酚比色法[15]，以牛血清白蛋白溶液（0.22 mg/mL）为对照品，绘制出标准曲线，计算线性回归方程，并从回归方程中计算总肽的含量。

2.3 不同分子量肽体外抗氧化能力的测定

2.3.1 对DPPH 自由基清除能力的测定

精确称量4.10 mg DPPH，溶解到100 mL 无水乙醇中，配制成浓度为6.5×10-5mol/L DPPH 乙醇溶液。分别吸取1 mL 样液与1 mL DPPH 的无水乙醇溶液置于试管中，摇匀，在室温反应30 min 后在波长517 nm 处测定吸光度（A）i；分别吸取1 mL 样液和无水乙醇于试管中，摇匀，室温反应30 min 后在517 nm 波长处测定吸光度（A2）；最后分别吸取1 mL DPPH 无水乙醇溶液与无水乙醇于试管中，摇匀，在室温反应30 min 后在517 nm 波长处测定吸光度（A0）[16]。按公式（1）计算清除率。

2.3.2 对ABTS+自由基清除能力的测定

取7 mmol/mL 的ABTS 溶液15 mL，室温下与等体积的4.9 mmol/mL 过硫酸钾溶液混合后暗处放置12 h，制成 ABTS+储备液，再用 pH 7.4 的 PBS 稀释 20 倍制成ABTS+工作液。取不同浓度的样品溶液和谷胱甘肽溶液1 mL，加入2.0 mL 的ABTS+工作液，震摇均匀后常温暗处放置10 min，在734 nm 波长处测吸光度[17]。按公式（2）计算清除率。

式中：A1为样品组吸光度，A2为样品本底吸光度（以等体积蒸馏水代替ABTS+溶液），A0为空白对照组吸光度（以等体积蒸馏水代替样品溶液）。

2.3.3 不同分子量猪皮胶原肽组分对O2-·活性清除能力测定

邻苯三酚自氧化速率的测定参照李婷等[18]的测定方法。不同分子量猪皮胶原肽抑制邻苯三酚自氧化速率的测定则按上述步骤，加入pH=8.2 缓冲液4.7 mL，然后分别加入不同分子量的猪皮胶原肽溶液，以蒸馏水补至4.2 mL，加入0.3 mL 邻苯三酚迅速摇匀，同样以10 mmol/L 盐酸溶液作为空白管，同上测定。按公式（3）计算加入猪皮胶原肽后邻苯三酚的自氧化速率，按公式（4）计算清除率。

式中：A3为 30 s 时的吸光度；A4为 4 min 时的吸光度；△A0为邻苯三酚自氧化速率，△A 为加入猪皮胶原肽溶液后邻苯三酚的自氧化速率。

2.3.4 不同分子量猪皮胶原肽组分对·OH 的清除能力测定

精密量取150 mmol/L pH=7.4 磷酸盐缓冲液2.0 mL、7.5 mmo1/L 邻二氮菲 0.2 mL、7.5 mmol/L 硫酸亚铁溶液0.2 mL、不同猪皮胶原肽组分试样0.4 mL、蒸馏水0.8 mL、体积分数0.1%过氧化氢0.4 mL 于试管中，混匀做试样组，将各试管同时于37 ℃恒温放置1 h，在536 nm 处测定吸光度。空白组以蒸馏水代替样品，其余步骤同试样组；空白对照组以蒸馏水分别代替试样和双氧水，其余步骤同试样组[19-20]。按公式（5）计算·OH清除率。

式中：A试样为试样组的吸光度值，A0为空白组的吸光度值，A空白对照为空白对照组的吸光度值。

2.4 不同分子量胶原蛋白肽体内抗氧化活性的测定

2.4.1 小鼠分组饲养和运动训练

按照体重进行随机分组，共分成4 个组，一个对照组和3 个实验组。且每组多养2 只～3 只预防灌胃或者运动训练时溺水发生意外。日常自由采食饮水，灌胃饲养35 d，灌胃时间安排在运动前2 h，对照组灌胃双重蒸馏水，实验组分别给予3 个不同分子量段的酶解肽液，饲养量为动物体重的3%。每天游泳训练一次，每次 20 min，水温（30±2）℃，不负重。

2.4.2 血清的制备

运动后休息30 min，用暖风机烘干小鼠，取血试管预先加入肝素抗凝剂（12 500 单位稀释30 倍），并低温烘干。颈动脉无麻醉状态下取血，摇匀，即刻再放回冰浴中冷却，3 000 r/min 离心10 min，分离血清，然后将血清倾入另一洁净试管低温保存备用。

2.4.3 指标测定

按照试剂盒指定的方法测定微量丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量、总超氧化物歧化酶（Total superoxide dismutase，T-SOD）活力、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-PX）活力、总抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC） 和过氧化氢酶（Catalase，CAT）活力。

3 结果与分析

3.1 不同分子量胶原蛋白肽的含量测定结果

福林酚比色法标准曲线见图1，不同分子量猪皮胶原蛋白肽含量测定结果见表1。

图1 福林酚比色法标准曲线Fig.1 Standard curve of fosinophenol colorimetric method

3.2 不同分子量胶原蛋白肽的抗氧化能力测定结果

3.2.1 不同分子量胶原蛋白肽对DPPH 自由基清除能力的测定结果

不同分子量胶原蛋白肽对DPPH 自由基清除能力的测定结果见图2。

表1 不同分子量猪皮胶原蛋白肽含量测定结果Table 1 Determination of collagen peptide content in pig skin with different molecular weight

图2 DPPH 自由基清除结果Fig.2 DPPH radical scavenging results

根据图2 可以看出，在0～6 mg/mL 的肽浓度内，不同分子量猪皮胶原肽对DPPH 自由基都有一定的清除作用，且随着猪皮肽浓度的增加，各组分对DPPH 自由基的清除率也随之升高。其中，M＜1 kDa 组分和1 kDa＜M＜3 kDa 组分对DPPH 自由基的清除能力相近，清除率最高分别可达到87.73%、84.11%；酶解原液最大清除率为73.15%，而M＞3 kDa 组分的清除能力比酶解原液要弱，最大清除率为68.58%。

3.2.2 不同分子量胶原蛋白肽对ABTS+自由基清除能力的测定结果

不同分子量胶原蛋白肽对ABTS+自由基清除能力的测定结果见图3。

图3 ABTS+自由基清除结果Fig.3 Results of ABTS+radical scavenging

根据试验结果可以看出，在0～1 mg/mL 的肽浓度范围内，3 个不同分子量肽段对ABTS+自由基清除能力大体一致。在肽浓度小于0.5 mg/mL 时，M＜1 kDa 组分和1 kDa＜M＜3 kDa 组分的抗氧化能力相近，并略强于 M＞3 kDa 组分；而在 0.5 mg/mL～1.0 mg/mL 范围内，M＞3 kDa 组分的抗氧化能力最强，清除率最高可达到91.22%。

3.2.3 不同分子量猪皮胶原肽组分对O2-自由基清除能力的测定结果

不同分子量猪皮胶原肽组分对O2-自由基清除能力的测定结果见图4。

图4 O2-自由基清除结果Fig.4 Results of O2-free radical scavenging

通过比较各组分对O2-自由基的清除率，M＜1 kDa组分与1 kDa＜M＜3 kDa 组分的清除能力最强，酶解原液次之，3 kDa 组分最弱。并且随着肽浓度的增加，各组分对O2-自由基的清除率也升高，并逐渐趋于稳定。

3.2.4 不同分子量猪皮胶原肽组分对OH 自由基清除能力的测定结果

不同分子量猪皮胶原肽组分对OH 自由基清除能力的测定结果见图5。

图5 OH 自由基清除结果Fig.5 OH radical scavenging results

试验结果显示，各组分对OH 自由基清除能力的顺序为：小于 1 kDa 组分＞1 kDa～3 kDa 组分＞大于 3 kDa组分，并且说明不同分子量猪皮胶原肽对OH 自由基清除存在量效关系。在肽浓度为5.4 mg/mL 时，各组分的清除率达到最高，分别为79.13%、63.24%、42.85%。

3.3 各组分猪皮胶原肽体内抗氧化活性的测定结果

各组分猪皮胶原肽体内抗氧化活性的测定结果见图6。

图6 各组分猪皮胶原肽的体内抗氧化指标测定结果Fig.6 Determination of antioxidant indexes of pig skin collagen peptides in vivo

从图6 可以看出，实验组小鼠血清中的SOD、CAT、GSH-PX、T-AOC 与正常对照组比较均增大。MDA 是一种脂质过氧化产物，可以直接反映机体的过氧化水平，各实验组的MDA 生成量均比对照组有明显下降。经方差分析，各实验组与对照组之间均具有统计学差异性（P＜0.05），此外，M＜1 kDa 组与 1 kDa＜M＜3 kDa 组无显著性差异，而M＞3 kDa 组与另外两个实验组均存在显著性差异。表明该法酶解得到的不同分子量的猪皮蛋白肽有着良好的体内活性，说明利用酶解液灌胃小鼠具有提高生物抗氧化能力的功效，从而对机体起到保护作用。

4 结论

本实验采用在pH 渐变条件下使用碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶分步酶解，再超滤分离纯化，通过研究不同分子量肽段的体内外抗氧化能力，表明此方法酶解得到的各组分猪皮胶原肽均有一定的抗氧化活性，经过综合比较，M＜1 kDa 组分的抗氧化活性最强，1 kDa＜M＜3 kDa 组次之，M＞3 kDa 组最弱，说明分子量大小会影响肽的抗氧化活性。本实验在保证抗氧化活性的前提下达到了节约成本、降低肽损失的目的，证明此方法可行，以期为猪皮胶原肽的酶解方法提供新的参考。