0#柴油中的水溶性石油烃对中华绒螯蟹溞状幼体的急性毒性

孙娜, 侯鑫, 万红芳, 刘胥, 梁芳

(1.盘锦光合蟹业有限公司，辽宁省中华绒螯蟹育种重点实验室 辽宁省，盘锦市 124200； 2.大连海洋大学 辽宁省，大连市)

中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)，又称河蟹，是中国的传统经济蟹类，每年的繁殖期将洄游至海水区或者是河口半咸水域进行繁殖。其幼体发育可分为溞状幼体(Ⅰ～Ⅴ期)和大眼幼体两个阶段[1]，这两个阶段是河蟹育苗中的两个关键幼体时期。特别是溞状幼体时期对外界环境的抵抗能力较弱，易受水中有毒物质的影响，造成生长发育不良甚至死亡。2014年Julie等[2]研究了石油水溶性成分对泥蟹(Rhithropanopeusharrisii)幼体的急性毒性实验，表明石油水溶性成分对其有明显的毒性作用。因此，探究溞状幼体时期对有毒物质的耐受性对于河蟹育苗具有重要的意义。

盘锦地处辽河平原南部的辽河三角洲核心地带，是中国北方河蟹的主产区，同时盘锦地区地下也蕴藏着丰富的油气资源[3]。随着油气资源的滚动开发和石油化工企业的迅猛发展，石油烃类污染物在石油勘探、开采、炼制和加工运输过程中以含油废水、落地原油和含油废弃泥浆等形式进入水体、土壤中，目前该区域水环境已经受到不同程度的石油污染[4]。溶解分散在水体的石油烃是石油类污染物对水生生物产生直接毒性的成分，主要包括多环芳香烃、直链和支链烷烃、环烷烃与不饱和烃[5]。尤其是其中的多环芳香烃，不易降解，在水体和生物体内的残留时间较长[6]。多环芳烃对锯缘青蟹(Scyllaserrata)、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)、普通滨蟹(Carcinusmaenas)等蟹类均有明显的毒性效应[7-9]。盘锦地区是中国北方中华绒螯蟹蟹苗的主产地，而且因为盘锦石油的开发，已有部分地区的水体受到污染，所以拟通过本次研究为科学评价水溶性石油烃对中华绒螯蟹各期溞状幼体的毒性提供依据，同时为河蟹养殖环境风险预警监测提供数据参考，对于合理规避河蟹养殖过程中影响河蟹健康生态养殖的环境风险因子具有良好的指导意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

中华绒螯蟹种蟹取自盘锦光合蟹业三角洲基地室外育苗池，在室内暂养10 d至排幼，取发育变态、整齐和活力好的个体，经显微镜鉴定，分别为Z1、Z2、Z3、Z4、Z5期幼体，用于毒性实验。

过滤海水:在光合蟹业三角洲基地室外幼体培育池中取水，经过24 h沉淀，用200目筛绢网过滤后充气备用。盐度范围为19～21，pH为8.6～8.7。

配置水溶性石油烃母液:将0#柴油(采购自中国石油盘锦加油站)和过滤海水按体积比 1∶1混合，加入助溶剂无水乙醇和表面活性剂吐温-80各1mL，用磁力加热搅拌器连续搅拌10 h后，在分液漏斗中静置4 h，分离的下层液体即为水溶性石油烃母液[5]。用紫外分光光度计法测定母液浓度[10]后，置于冰箱(4 ℃)保存。

1.2 试验方法

采用静水式急性毒性试验法。试验容器为500 mL的烧杯,试验总水体体积为400 mL，投放试验幼体10只。根据预实验结果将石油烃分散液母液按等对数间距(以10为底数)稀释成4.56、6.53、9.33、13.36、19.00和27.36 mg/L 6个质量浓度梯度，每个浓度梯度设置3个平行组，另设一个空白对照组。每期幼体试验时间为48 h,每24 h更换一次试验液体。试验液体温度变化范围是20～23 ℃。在试验开始后第24小时和第48小时观察死亡情况，并记录幼体死亡数。幼体死亡以沉底发白、对刺激无反应为准。

本实验pH值测定采用三信PHB-1型便携式pH计，溶解氧测定采用YSI-55A型便携式溶氧仪。整个实验过程水温控制在20～23 ℃范围内，pH为8.6～8.7，溶解氧含量为5.5 ～7.5 mg/L。

1.3 数据处理

1.3.1 校正死亡率

自然死亡校正采用Abbot[11]的公式，具体计算方法见式(1)。

P=(P′-C)/(1-C)

式(1)

式中，P为校正后的自然死亡率(%)，P′为试验组死亡率(%)，C为对照组死亡率(%)，其中各相应数据均为3个平行组的算术平均数。

1.3.2 半致死浓度、安全浓度计算

利用SPSS 21(IBM，美国)中Probit模块(概率单位回归)分析数据，得到死亡几率与浓度对数的线性回归方程，并利用卡方检验确定线性回归方程的拟合优度，同时求出24h和48h的LC50及其95%的置信区间[12-13]。

安全浓度采用Turubell 氏公式计算[14]，见式(2)。

式(2)

其中SC为安全浓度，24 hLC50为24 h的半致死浓度，48 hLC50为48 h的半致死浓度。

2 结果分析

2.1 中华绒螯蟹溞状幼体的中毒症状

中华绒螯蟹各期溞状幼体对不同浓度的水溶性石油烃的中毒反应相似。实验开始6 h内，低浓度组(4.56和6.53 mg/L两组)以及空白对照组的幼体活动状况无明显差异，趋光性较强，大多在水体的中下层活动，触底后腹部收缩，弹跳有力。中浓度和较高浓度组(9.33、13.36和19.12 mg/L)，1小时后幼体活性与对照组相比，明显下降，3小时后陆续出现死亡个体。然而27.36 mg/L 浓度组投入幼体后，幼体活动异常，在水体下层打转，不时撞向烧杯壁，突然失去平衡，头部朝下撞到杯底。有的头部贴着杯底，腹部伸展，间歇式抽搐；也有少许在杯底匍匐移动，无力弹跳；试验进行至15 h后幼体趋光性变差，体色发白的程度越来越明显，直至完全发白而死亡。

2.2 水溶性石油烃对中华绒螯蟹各期溞状幼体急性毒性

由试验中幼体的中毒症状及表1数据可看出，随着水溶性石油烃浓度的增加和作用时间的延长，中华绒螯蟹的各期溞状幼体的校正死亡率逐渐提高，水溶性石油烃的浓度和作用时间共同影响了中华绒螯蟹溞状幼体的死亡率。

通过SPSS对数据进行分析，由表2可知，各期幼体24 h的半致死浓度(LC50)顺序依次为：Z1

2.3 毒性评估

参照《环境监测技术规范》生物监测(水环境部分)[15]，由表4可知LC50在1～100 mg/L为高毒。而本次研究中24 h和48 h毒性实验的LC50的值均在1～100 mg/L之间，所以0#柴油的水溶性石油烃对中华绒螯蟹溞状幼体是高毒物质，对其有严重的毒害作用，应引起人们的高度关注。

表1 水溶性石油烃对中华绒螯蟹各期溞状幼体的毒性Tab.1 The toxicity of water-soluble petroleum hydrocarbons to zoea (Z1～Z5) of Eriocheir sinensis n=3

表2 水溶性石油烃对中华绒螯蟹各期溞状幼体的毒性特征的分析Tab.2 The toxicity characteristic analysis of water-soluble petroleum hydrocarbons to zoea (Z1～Z5) of Eriocheir sinensis

表3 水溶性石油烃浓度对数与中华绒螯蟹各期溞状幼体死亡几率的线性回归关系Tab.3 The linear regression analysis of the concentration logarithm of water-soluble petroleum hydrocarbons to the mortality rate of zoea (Z1～Z5) of Eriocheir sinensis

注：线性回归方程中，x为水溶性石油烃浓度对数值，y为中华绒螯蟹各期溞状幼体死亡几率; “***”表示P值在0.001水平上显著相关。

表4 化学物质对水生生物的毒性分级Tab.4 Toxicity grades of chemical substances to aquatic organisms mg·L-1

3 讨论

海洋生物在幼体阶段对石油类污染物均较为敏感，主要由于其神经中枢和呼吸器官等重要部位接近体表，而表层皮膜一般较薄，有毒物质容易入侵，并且幼体的运动能力相对成体较差，遇到污染环境，不能及时逃离。因此一旦出现石油类污染物泄漏事故，不仅会威胁海洋生物成体，对其幼体的毒害作用更甚[16]。本次研究中根据预实验的结果在石油烃质量浓度4.56～27.36 mg/L的范围内进行浓度的梯度设计，而实验选择的盐度19～21为中华绒鳌蟹溞状幼体生长发育最适的盐度范围。

本实验过程中幼体出现的沉底、撞壁、活力减弱以及身体发白等中毒现象与沈和定等[17]的甲醛对中华绒螯蟹各期溞状幼体及波海红胞藻(RhodomonasbalticaKarsten, 1898)的急性毒性和卢伟等[18]的新洁尔灭对中华虎头蟹(Orithyiasinica)幼体的急性毒性试验中的溞状幼体中毒症状是相似的。由于石油烃的成分组成复杂，不同种类水生生物或同种水生生物的不同发育阶段对同种石油烃的耐受性是不同的。0#柴油分散液对马粪海胆(Hemicentrotuspulcherrimus)幼虫24 h和48 h的半数效应浓度为18.2和15.5 mg/L[19]，而对小球藻 (Chlorellavulgaris)的24 h和48 h半数效应浓度为23.53和14.39 mg/L[20]，对菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)的24 h半致死浓度为52.6 mg/L[21]。本实验结果中，0#柴油水溶性石油烃对溞状幼体的24 h和48 h半致死浓度均低于马粪海胆幼虫、小球藻以及菲律宾蛤仔，说明中华绒螯蟹溞状幼体对石油烃的耐受性低，相比于马粪海胆幼虫、小球藻以及菲律宾蛤仔，中华绒螯蟹溞状幼体对石油烃的敏感性高。由表1中同一浓度组下不同阶段幼体的的校正死亡率随着幼体的发育呈下降趋势；同一发育阶段随着浓度增加校正死亡率上升的规律，可证明各期溞状幼体对0#柴油的水溶性石油烃的耐受性是不同的。

本次实验的局限性在于，没有测定0#柴油中石油烃的化学成分以及石油烃对中华绒鳌蟹溞状幼体抗氧化系统的影响。目前许多学者在对石油烃的毒性研究中发现为, 芳烃的含量是决定毒性大小的关键因素[22-23]。多环芳烃环氧化物被认为是多环芳烃致癌及致突变的重要活性代谢产物，因其具有亲电子特性，可以和生物大分子尤其是分子相互作用,形成多种类型的DNA损伤,如加合物、链断裂以及碱基的非正常化学修饰或缺失等[24-25]。石油污染物的毒性与其中含有的可溶性芳烃衍生物(如苯、萘、菲及它们的烷基衍生物)的含量呈正比关系[26]。此外，水生生物对石油烃等污染物进行生物转化的代谢过程中会产生大量自由基，主要是生物转化酶引起的氧自由基含量增加和污染物中间代谢物的氧化还原循环，而过量的自由基可对机体产生广泛的氧化损伤[27]。张林宝等[28]的研究同样表明，0#柴油水溶性成分对菲律宾蛤仔的抗氧化系统造成了损伤。因此，在研究石油烃对水生生物的毒性时，不仅要考虑石油烃的成分，还应该考虑生物本身代谢的机理，今后的实验中将加深这方面的研究。