3 种马兜铃酸和2 种马兜铃内酰胺在北细辛、华细辛及汉城细辛不同部位的分布及含量分析＊

张翠英，俞 捷，刘广学，徐 风，尚明英，李耀利，王 璇，小松かつ子，朱 姝，蔡少青＊＊

（1.北京大学药学院 北京 100191；2.中国中医科学院广安门医院 北京 100053；3.云南中医药大学 昆明 650500；4.日本富山大学和汉医药学综合研究所 富山 930-0194）

因美国《Sci Transl Med》杂志2017 年刊登的马兜铃酸及其衍生物在台湾和亚洲地区与肝癌相关的论文[1]，医药学界及民众中又引发了关于含马兜铃酸药物毒性的讨论热潮。马兜铃科中含马兜铃酸中药成为热门话题，其中也包括常用的辛温解表药细辛。国家食品药品监督管理局为此于2017 年10 月又连续推出了有关马兜铃酸的公告，介绍含马兜铃酸药品使用的安全情况；《中国中医药报》和《人民日报》等也相继发表评论，引导民众正确看待含马兜铃酸药品使用的安全性以免引起民众恐慌。其实自2003年以来，我国政府部门已对含马兜铃酸药材及中成药采取了一系列风险控制措施，包括取消马兜铃酸含量高的关木通、广防己和青木香的药用标准；以及将细辛的药用部位由全草修订为根和根茎。然而相关马兜铃酸在中药细辛分布的研究文献存在实验所用样本较少（1-7 份）、数据的代表性差等问题[2-4]，易引发一些读者误解而造成民众用药的恐慌。

图1 3种马兜铃酸和2种马兜铃内酰胺的化学结构

细辛来源于马兜铃科植物北细辛Asarum heterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.、华细辛A.sieboldiiMiq.或汉城细辛A.sieboldiiMiq.var.seoulenseNakai。本课题组自1990年始，长期从事细辛的本草考证[5,6]、药材鉴定[5,7-9]、资源分布[5,10]、药效作用[11,12]、活性成分[13-17]和马兜铃酸类成分[18-20]等多方面研究工作。为了应对这次马兜铃酸风波，让公众了解马兜铃酸类成分在中药细辛中的分布和含量情况，有必要对细辛中具有毒性的马兜铃酸类成分的分布和含量情况进行较全面系统的报道，以利于细辛临床安全和合理用药。因此，我们整理了本课题组多年来有关细辛的研究结果，并开展了一些重复实验对以往的实验结果进行确证，形成本论文。本文采用HPLC-DAD 法，以3 种马兜铃酸及2 种马兜铃内酰胺即马兜铃酸I（aristolochic acid I；AA-I）、马兜铃酸II（AA-II）、9-羟基马兜铃酸I（9-hydroxy aristolochic acid I；9-OH AAI）、马兜铃内酰胺I（aristololactam I；AL-I）和马兜铃内酰胺II（AL-II）作为测定的指标成分，对中国药典收载的北细辛、华细辛和汉城细辛3 种植物的不同部位（果、叶、根及根茎）进行大样本的含量分析。

1 材料

1.1 仪器

HP1100型高效液相色谱仪包括四元泵、在线脱气机、柱温箱及DAD 检测器（美国安捷伦公司）；API 3000 三重四级杆液质联用仪（Perkin-Elmer Sciex Instruments 公司）；十万分之一的Sartorius 电子天平（德国Denvor 公司）；超声波清洗机（功率500W，天鹏电子新技术有限公司）；高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 对照品与试剂

AA-I、AA-II 混合对照品购于Sigma 公司（Lot 092K1249）（St. Louis，MO，USA），AA-I 和AA-II 各占40% 、56% ，作者采用半制备高效液相色谱仪分离纯化；AL-I 和AL-II 为AA-I 和AA-II 的合成品，亦采用半制备高效液相色谱仪分离纯化；9-OH AA-I 对照品为作者从天仙藤（北马兜铃Aristolochia contortaBge.的茎叶）中分离纯化获得[20]，这些化合物均经核磁、质谱等方法进行结构鉴定。9-OH AA-I、AL-II、AA-II、AL-I 和AA-I 对照品的纯度分别为99.13% 、98.81% 、98.20% 、98.69% 和99.48% ，其相应的化学结构见图1。

乙腈（HPLC级）美国Fisher公司提供；磷酸（HPLC级）Tedia 公司提供；高纯水为北京大学医学部医药卫生分析中心提供，并经0.45 μm水系滤膜滤过；其它均为分析纯。

1.3 细辛药材

本实验所用样品采自细辛的主产区，其中北细辛和汉城细辛采于主产区辽宁省本溪、抚顺和丹东等辽东地区；华细辛采于主产区陕西省，采集地遍及2 省7县12个乡镇18个自然村。采集时间跨越13年和细辛生长的夏、秋、冬3个季节（5月至11月）。采集共计81份全草样品和16份全草商品，其中30份样品带果（用*在编号右上角注明）。研究中将细辛样品分为细辛果、细辛叶、细辛根及根茎3 个部位。所有样品均经北京大学药学院蔡少青教授鉴定，凭证标本保存于北京大学药学院生药标本室。

2 方法与结果

2.1 HPLC色谱条件

Zorbax SB-C18（4.6 mm×25 cm，5 μm）色谱柱和Zorbax SB-C18（4.6 mm×1.3 cm，5 μm）保护柱（美国安捷伦公司）。流动相为乙腈-7.4mM 磷酸缓冲液（pH=2.34）梯度洗脱，0→15 min，40% 乙腈；15→16 min，40% 乙腈→45% 乙腈；16→29 min，45% 乙腈；29→30 min，45% 乙腈→100% 乙腈。流速1.0 mL·min-1，柱温30℃，进样量20 μL。

2.2 LC-MS条件

Zorbax SB-C18（4.6 mm×25 cm，5 μm）色谱柱和Zorbax SB-C18（4.6 mm×1.3 cm，5 μm）保护柱（美国安捷伦公司），ESI 离子源（正离子源），以m/z359→324，m/z359→298，m/z359→296 三对母子离子对进行多反应监测（multiple reaction monitoring,MRM）。流动相为乙腈-水（0.2% 醋酸和1mM 醋酸铵）进行梯度洗脱，流速：0.6 mL•min-1，进样量20 μL。

表1 3种马兜铃酸及2种马兜铃内酰胺的标准方程

2.3 供试品溶液的制备

分别精密称取细辛的果、叶或根及根茎样品（粉碎过40目筛）0.5 g，置于具塞三角瓶中，精密加入70% 甲醇25 mL，称重，超声处理40 min，用70% 甲醇补足失重，过滤，续滤液过0.45 μm 微孔滤膜，即得供试品溶液。所有细辛的样品液制备、HPLC 含量测定及LCMS法检测的前期工作均系于2003年9月-2004年4月期间内完成。

2.4 HPLC的方法学考察

2.4.1 标准曲线的制备及检测限

精密称取AA-I、AA-II、9-OH AA-I、AL-I、AL-II对照品适量，加甲醇分别配制成系列标准溶液（AA-I：

0.53、2.65、5.30、10.60、15.90、21.20、26.50 μg·mL-1；AA-II：0.376、0.940、1.504、1.880、2.444、3.196、3.760 μg·mL-1；9-OH AA-I：0.2、0.5、0.8、1.0、1.3、1.7、2.0 μg·mL-1；AL-I：0.468、1.170、1.872、2.340、3.042、3.878、4.680 μg·mL-1；AL-II：2.04、4.08、6.12、8.16、10.20、14.28、20.40 μg·mL-1）的溶液。进样量20 μL，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，回归计算标准方程（表1）。以电信号是噪音的三倍时的浓度为检测限。混合对照品及细辛样品分离情况见图2。

2.4.2 精密度试验

取同一份供试品溶液（编号为025008 果）连续进样5次，每次20 μL，根据5次的峰面积积分值，计算马兜铃酸及马兜铃内酰胺的含量，并计算RSD，AA-I、9-OH AA-I、AL-I、AL-II 的RSD分别为0.56% 、1.08% 、0.97% 和2.92% ，说明仪器的精密度良好。

2.4.3 重复性试验

图2 混合对照品和细辛样品的HPLC色谱图

取同一份样品（编号为025008果）5份，每份0.5 g，照供试品溶液制备方法制得5 份供试品溶液，进样20 μL，根据5 次的峰面积积分值，计算马兜铃酸及马兜铃内酰胺的含量，并计算RSD，AA-I、9-OH AA-I、AL-I、AL-II 的RSD分别为2.55% 、0.74% 、0.72% 和2.45% ，说明供试品溶液的重复性良好。

2.4.4 稳定性试验

取同一份供试品溶液（编号为025008果），每隔2 h进样一次，连续进样7次，根据峰面积积分值计算马兜铃酸及马兜铃内酰胺的含量，并计算RSD，AA-I、9-OH AA-I、AL-I、AL-II 的RSD分别为0.11% 、0.66% 、0.31% 和0.95% ，说明供试品溶液在12小时内基本稳定。

2.4.5 加样回收率试验

精密称取细辛果（编号025008）粉末6 份，分别加入3 种马兜铃酸及2 种马兜铃内酰胺混标溶液（AA-I 0.26 mg·mL-1、AA-II 0.032 mg·mL-1、9-OH AA-I 0.024 mg·mL-1、AL-I 0.0366 mg·mL-1、AL-II 0.0959 mg·mL-1）1mL，照供试品溶液的制备方法得到加样供试品溶液，进样20 μL，计算3种马兜铃酸及2种马兜铃内酰胺的加样回收率和RSD（% ），AA-I、AA-II、9-OH AA-I、AL-I、AL-II 的平均加样回收率分别为99.4% （RSD为0.62% ）、98.0% （RSD为1.08% ）、100.0% （RSD为0.38% ）、100.0% （RSD为0.36% ）和99.6% （RSD为1.55% ）。

2.5 样品测定结果

将30 份带有果的样品分为果、叶和根及根茎3 部分；将无果的67份样品分为叶和根及根茎2部分。通过与3种马兜铃酸及2种马兜铃内酰胺对照品的保留时间和DAD检测器的UV光谱图比对进行样品中相应色谱峰的指认，根据峰面积积分值计算3 种马兜铃酸及2种马兜铃内酰胺的含量，北细辛、汉城细辛和华细辛的不同部位的含量结果分别见表2-表4，HPLC的综合检测结果见图3。其中97份细辛根及根茎样品均未检测到3种马兜铃酸及2种马兜铃内酰胺中任何一种成分；叶和果中均未检测到AA-II；AA-I在细辛果和叶（除了2 份叶样品）中均有分布，但含量差异较大；9-OH AA-I、AL-I和AL-II只在细辛果中检测到，而叶中均未检测到这3种成分。

2.6 细辛根及根茎中微量的AA-I的确认

为进一步确认AA-I 在细辛根及根茎究竟是否确有微量分布，分别取2份北细辛（编号1194和025081）和2份华细辛（编号951015和1161）的根及根茎样品，采用高灵敏度LC-MS 法进行检测。将AA-I 的359.4[M+NH4]+碎片进行MS2，结果母离子m/z359 的碎片为m/z359、342、324、296、298，与文献报道[4]一致，对离子碎片的解析也非常合理。根据AA-I 的一级和二级MS，选择母离子m/z359 与子离子m/z324、298、296 三对离子碎片进行MRM检测，结果在4份细辛根及根茎中均检测到AA-I。根据峰面积积分值计算，4 份细辛根及根茎中AA-I的含量分别为0.4、1.7、1.3、2.4 μg•g-1。

3 讨论

3.1 供试品溶液制备的优化

本实验以3 种马兜铃酸及2 种马兜铃内酰胺为指标，分别对不同提取溶媒（乙醇、乙腈-7.4 mM 磷酸缓冲液（pH=2.34）、50% 甲醇、70% 甲醇、85% 甲醇、甲醇和四氢呋喃）、不同提取方法（超声提取法、冷浸提取法、热回流提取法）、不同提取时间（20、40 和60 min）和不同溶媒量（10 mL、25 mL、50 mL、100 mL）进行了考察，最终确定以50 倍70% 甲醇为提取溶媒、超声提取40 min的制备方法。

3.2 细辛根及根茎中AA-I的检测

马兜铃酸是广泛存在于马兜铃科植物的硝基菲酸，因马兜铃酸被报道与肾病和肝癌等发生相关而广受关注，主要包括AA-I、AA-II等化合物[21]，其中AA-I是导致肾毒性和致癌性的主要成分[21-25]。鉴于AA-I的LC-MS 法检测灵敏度（检测限为4.6 ng·mL-1）高于HPLC-DAD 法（检测限为10.6 ng·mL-1；相当于生药中AA-I的检测检测限为0.53 μg•g-1），本研究测定4份细辛根及根茎样品的LC-MS检测结果表明，尽管在本实验HPLC 色谱条件下难以检测到AA-I 在细辛根及根茎的存在，但AA-I 在细辛根及根茎确有微量的分布，即4 份细辛根及根茎中AA-I 的含量分别为0.4、1.7、1.3、2.4 μg•g-1。薛燕等[3]曾报道测定7份细辛（根及根茎；但未给出物种名称）中AA-I含量为0.476-5.00 μg•g-1；Zhao Z Z 等[4]也曾报道AA-I 含量在汉城细辛（1 份根）和北细辛（2 份根）中分别为0.19、2.16 和0.93 μg•g-1；而按照本研究HPLC 实验的检测限可以推测，即使本研究中97 份细辛根及根茎中均分布有少量AA-I，其含量也应该在0.53 μg•g-1以下（考虑到与LC-MS 方法间的测定误差，此数值可提升至约2.5 μg•g-1以下）而远低于《中国药典》规定的限度10 μg•g-1，这对薛燕等及Zhao Z-Z等[3,4]的结果是一个支持。

3.3 细辛药用部位的取舍探讨

根据本实验HPLC和LC-MS法检测3种马兜铃酸及2种马兜铃内酰胺在细辛3个药用部位的总体分布（图4 和表5），2 种马兜铃酸及2 种马兜铃内酰胺分布于细辛的果，其中AA-I含量高达2.2 mg•g-1，接近于青木香（Aristolochia debilis根）和马兜铃（A.contorta果）的含量级别[26-28]；AA-I也存在于细辛叶（最高达0.140 mg•g-1）中，含量接近于天仙藤（A.contorta地上部分）中AA-I的含量级别[26]。薛燕等[3]曾报道测定7份细辛茎叶（未给出物种名称）中AA-I 含量为0.0059-0.071 mg•g-1；Zhao Z Z 等[4]也曾报道AA-I 含量在2 份北细辛地上部分中为0.0061-0.0119 mg•g-1；本研究测得的细辛叶中AA-I最高含量是这2篇文献中含量数据的2-10倍，提示细辛叶中AA-I含量变化范围较大，存在导致安全问题的风险，而以往文献仅测定少数样品不足以充分反映AA-I 的含量情况。本草古籍原本记载细辛药用部位为根（含根茎）[5,6]，但因资源匮乏、用量紧缺等原因而导致20 世纪60 年前后细辛以全草代替了本草记载的根及根茎[6]，致使2000 版以前的《中国药典》均记载细辛的药用部位为全草（而同期的及当前的《日本药局方》均始终记载根及根茎作为细辛的药用部位）。故基于本课题组的数据及修订建议，自2005年版始，《中国药典》收载的细辛药用部位订正为北细辛、华细辛或汉城细辛的根及根茎[29]，而不再是全草。为保证细辛的用药安全，2010年版《中国药典》又根据本课题组的建议增加了AA-I 的HPLC 限量检查，规定AA-I 不得过0.001%[30]；规定这个限量主要是为了防止细辛地上部位特别是叶柄残基混入细辛药材，而不是为了防止细辛药材（根及根茎）本身的AA-I超标。

表2 3种马兜铃酸及2种马兜铃内酰胺在北细辛不同部位的分布

续表

表3 3种马兜铃酸及2种马兜铃内酰胺在汉城细辛不同部位的分布

表4 3种马兜铃酸及2种马兜铃内酰胺在华细辛不同部位的分布

图3 北细辛、汉城细辛和华细辛中5种成分的HPLC检测结果

表5 3种马兜铃酸及2种马兜铃内酰胺在细辛不同部位的总体分布

图4 3种细辛不同部位中3种马兜铃酸及2种马兜铃内酰胺总量的分布图

3.4 有关英国学者[31]报道细辛含大量马兜铃酸衍生物的质疑

近期英国学者报道细辛属植物中检测到大量马兜铃酸衍生物，尤其是强调中国药典品种细辛（北细辛和华细辛的根及根茎）中也检测到大量的马兜铃酸及马兜铃内酰胺类；我们仔细研读该文，发现该论文既没有进行定量测定也没有其他充分可靠的实验资料支撑其结论。该论文中存在的主要问题如下。

3.4.1 该论文中的多数实验样品均未准确鉴定物种，实验结果应用在《中国药典》细辛“头上”不妥。

我们发现该论文[31]中存在细辛来源不清（未能鉴定到具体物种）的问题：即总共38 份细辛属样品中有31 份为商品，因多数样品（27 份）无法鉴定具体的物种，故只在括号内标注可能为细辛属植物或具体哪个种的细辛属植物。仅有4份商品（32、33、35和36号样品）被明确地鉴定为《中国药典》收载的细辛。作者把市场上被叫做“Xixin”的商品药材简单地认为不是来源于华细辛就是来源于北细辛（见原文第5 页左列第19-21 行），这样未能准确鉴定物种的样品有27 份之多，这种“想当然地认定药材基源”的做法很不科学。

我课题组在以往资源调查研究过程中，发现一些地区把非药典收载的细辛属植物如杜衡A.forbesii、青城细辛A.splendens等作为“细辛”药用[10]，而药材碎断、无花果的细辛商品药材一般人常常难以鉴定具体物种，混杂或冒充的细辛难免进入流通领域。所以该论文[31]通过检测被认为可能为《中国药典》收载的“细辛”样品，从而就做出细辛中可检测到较大量马兜铃酸类衍生物的结论未免太武断了。

3.4.2 既未进行定量研究又无充分的实验资料，不足以支撑做出“《中国药典》细辛中含有多种马兜铃酸及其类似物因而构成用药安全”的结论。

（1）该论文作者[31]采用LC-MS法对样品中16种马兜铃酸和马兜铃内酰胺类成分进行定性分析，无具体含量数据，只用以峰面积大小表示的热图（heat map）来表示马兜铃酸类衍生物的含量高低。

（2）该论文作者[31]在论文前言中提及AA-I和AAII 是主要的肾毒性成分，然而AA-II 在38 份细辛属样品均未检出。而肾毒性最大的AA-I 只在4 份实验样品中检出，其中仅一份北细辛（其编号为32号，但其植物部位虽然在TABLE1 中标明为“根及根茎”，而在FIGURE1 中却标示为“叶”。我们根据该论文中35 号及36 号华细辛分别标注为“根及根茎”和“叶”的情况来推断，32号样品应该就是“叶”）检出AA-I，其余3份分别为“细辛”（21 号，未鉴定种的茎）、加拿大细辛A.canadense叶（14号）和青城细辛A.splendens叶（15号）；4份被明确鉴定为中国药典品种的细辛样品（北细辛2份和华细辛2 份）中仅1 份北细辛的叶（32 号）中检测到AA-I。此外，该论文虽然指出细辛属植物中的AAI 含量在地上部分与根之间没有差别，但是，我们注意到其实验结果是：在38 份样品中所有能明显检测到AA-I 存在的都是叶子或茎的样品（即上述4 份：14、15、21、32 号样品），而其他样品（包括所有的根样品）中均并未检测到AA-I的存在（这说明该论文的实验结果也表明细辛属植物中的AA-I 含量在地上部分与根之间存在差异）。

（3）而对于另一种肾毒性成分AL-I，虽然仅有的4份药典品种细辛（北细辛和华细辛均叶和根及根茎各1份）中2份根及根茎中均检测到比叶多的AL-I，然而该论文作者[31]并没有进行定量研究，未提供其含量数值。我们本次报告的数据显示，3种细辛原植物（北细辛、华细辛和汉城细辛）的97份叶样品和97根及根茎样品中均未检测到AL-I的存在，只有果实样品中检测到了AL-I，而果实中最低检测到的含量是0.025 mg•g-1；因此《中国药典》品种细辛的根及根茎中如若存在ALI的话，其含量也应该在0.025 mg•g-1以下。而该论文[31]中其他AL及其他AA类化合物在3份药典品种样品中根本没有检测到，只有北细辛叶（32 号）中检测到了AL-CIII（但热图强度小于根中AL-I），因此，说《中国药典》细辛中存在较多量的马兜铃酸类衍生物的结论根本没有实验依据（该论文作者至多只能强调长尾细辛A.caudatum、青城细辛A.splendens等非药典细辛中能检测到较多的AA类和/或AL类化合物）。

3.4.3 鉴于该论文作者[31]在该论文最关键的植物部位名词表述方面出现不止一处的错误，即如上所述把32号样品的北细辛植物部位搞错了，同时把38号花叶细辛A. cardiophyllum样品的部位也搞错了（TABLE1 中标明为“叶”，而在FIGURE1中标示为“根茎”），甚至据该论文作者自述（原文第7页上DISCUSSION的第四段第3-6 行）实验中他们把根本无法判断是否是来源于细辛属植物的一些样品也拿来当作细辛样品来进行测定。因此，我们认为该论文所强调的关于细辛属植物的叶或者根（根茎）中马兜铃酸衍生物分布情况的结论的可靠性存在很大的疑问。

4 结论

本研究通过检测大量的细辛采集样品和多省市的细辛商品，报道了3种马兜铃酸和2种马兜铃内酰胺在《中国药典》收载细辛不同部位中的分布和含量情况，为《中国药典》（2005 年版）把细辛药用部位由“全草”修订为“根及根茎”而保证细辛的临床用药安全提供了科学数据的支撑。据HPLC 实验推测，即使97 份细辛根及根茎中均分布有少量马兜铃酸I，其含量应在0.53-2.5 μg•g-1以下。