马兜铃酸致癌作用的分子毒理学关键点

2019-10-22王方园王亦男刘淑清

世界科学技术-中医药现代化 2019年7期

关键词：转运体马兜铃致癌物

马红，黄超，王方园，王亦男，刘淑清，杨凌

（1.上海中医药大学系统药物代谢动力学中心上海 201203；2.上海市针灸经络研究所上海 200030；3.大连医科大学基础医学院大连 116044）

1 致癌物评价基于对其固有特性的评价

1.1 马兜铃酸为何被确定为致癌物？

1.1.1 致癌物定义

致癌物是指可诱发或增加癌症发生率的化学物质或化学混合物，这是化合物的固有特性，因此，只要能反映出其固有特性，并依据固有特性产生的评价方式都可以作为衡量手段。这里需要指出其中包括了两个重要含义：①除非有明确的机理证据表明所引发的良恶性肿瘤在种属间有明显差异性重要事件或决定性事件，否则在动物中所发生致癌结果同样会发生于人体，也即动物致癌物也被视为或假设为人体致癌物；②致癌物的定义中涉及的第2个含义是指致癌物性质只取决于其物质的内在本性，不需要提供其在具体使用环节中致人体致癌风险的剂量及其环境相关信息[1,2]。

国际癌症研究机构，从1971年起组织专家组收集和评价世界各国有关化学物质对人类致癌危险性的资料，编辑出版《IARC 关于化学物质致人类癌症危险性评价专题论文集》，并于1979 年、1982 年和1987 年3次组织专家组对上述专题论文集所评价的环境因子和类别、混合物及暴露环境对人类的致癌性进行再评价，并出版报告。自1987 年专题论文集改名为《IARC 关于致人类癌症危险性评价专题论文集》，并扩展到物理因子、生物因子致人类癌症危险性评价。IARC 关于化学物质致人类癌症危险性分类只与一种化学物致癌性证据的充分性（证据权重）有关，而并不涉及其致癌活性大小及其机制[3]。

1.1.2 致癌物评价标准

国际上根据以下10条证据性事件（主要是分子毒理学证据）来分类、归属与定义致癌物：①本身或被代谢激活后是否产生亲电性；②是否产生基因毒；③是否改变基因修复或引发基因组不稳定性；？④是否诱发表观遗传学改变；⑤是否导致氧化应激作用；⑥是否诱发慢性炎症反应；⑦是否产生免疫抑制；⑧是否产生受体介导的调控效应？⑨是否导致细胞永生化？⑩是否改变细胞增殖、细胞死亡或营养供给？综上所述，致癌物评价标准关注的是致癌机制中最关键性、转折性事件，罗列于此的标准性事件可以通过不同方法与模型来实现。这些标准决定了分子毒理学的评价程序、信息收集与框架汇总，也是现行“3R”毒理学评判准则的依据。该标准中，需要把最基本或最重大的要素与事件从致癌过程与机制中模式化地提炼出来，模型中的关键要素，再综合考虑到具体测定方法的灵敏性、精确性、稳定性等，制订相应的评价方法与准则。因此，具体的评价方法是否用体内或体外方法，则完全取决于能否实施上述原则。

表1 致癌物的分子毒理学事件[2-4]

如表1所示，马兜铃酸作为致癌物的重要特征：①有明确致人体癌症的流行病学证据；②有亲电加合物形成的铁证；③有明确的突变标识特征（Mutational Signature）：“A:T→T:A颠换突变”。无论是加合物或是上述突变标识特征均可在体内外标本中发现。依据以上定义与分类原则，马兜铃酸被确认为致癌物。它还会引起人类癌症，所以被确认为“一级致癌物”[2,3]。

1.1.3 致癌物评价标准与机理研究的区别

在上述致癌物评价准则中，致癌过程和机制当然非常关键，但与致癌物标准不同的是具体致癌机制与过程取决于具体的模型对象，与模型的种属、个体、代谢能力、DNA修复过程等相关。研究对象不一定是标准化、模式化的，但可具有以上机制的代表性，这要根据机制研究强调的重点以及研究兴趣点而决定的。

1.1.4 加合物产生机制[5]

人类经常接触的各种环境、饮食中基因毒物性物质及内源性的亲电物质，这些活性物质可以破坏DNA并形成共价修饰，即产生DNA加合物。在肿瘤相关基因的关键位点上形成的DNA 加合物被认为是化学致癌作用的第一步。许多致癌物质在与DNA 共价结合之前需经代谢活化以形成反应中间体。这些代谢活化反应由体内代谢酶（I 相和II 相代谢酶）催化产生。这些活性反应中间体进一步与DNA上的碱基、磷酸基团或者脱氧核糖上的相关位点结合。而这种结合反应包括多种类型，即反应中间体可通过烷基化、双亲电子交联以及通过与脂质过氧化或自由基反应形成DNA 加合物。DNA 加合物的类型取决于反应性化学物质的结构、亲电性物质的性质以及反应中间体与DNA嵌入的能力，决定加合物与哪些DNA碱基的上亲核位点结合。加合物形成可发生在DNA的多个亲核位点，包括鸟嘌呤和腺嘌呤的C8原子、核碱基的环上和环外N和O 原子及胞嘧啶C5-甲基的氧化。其中，胞嘧啶C5 甲基的氧化是表观遗传学的重要标志。鸟嘌呤C8 原子氧化产生的7,8-二氢-8-氧鸟嘌呤(8-oxo-Gua)和2,6-二氨基-4-羟基-5-甲酰胺基(Fapy-Gua) 分别是氧化应激和基因毒性病变标志物。

1.1.5 碱基对替换突变特征与突变机制[6]

碱基替换是指基因组中碱基对被另一碱基对替换的现象。根据体细胞碱基置换方式，碱基对突变共有六种方式：C∙G→A∙T，C∙G→G∙C，C∙G→T∙A，T∙A→A∙T，T∙A→C∙G 以及T∙A→G∙C。可用于相对粗旷分析以及肿瘤类型或者外源性致癌物类型的分类[7]。马兜铃酸的主要碱基对替换特征是T∙A→A∙T 颠换[8]。此外，突变位置的侧翼序列以及突变碱基对相邻位置的碱基种类也影响突变率。碱基替换突变发生在DNA 损伤及修复或者DNA 复制的过程中。每种DNA损伤机制均有其相应的碱基偏好，从而形成特征性的突变模式。每一种特定的突变特征实质上都代表着不同的基因突变机理。因此，突变类型可以被视为致癌物的固有或内在特征。

上述的突变特征说明的是致癌物的固有特征。在机理研究中，则要说明这些特征意味着什么？例如，内源性DNA 损伤引起的突变模式与碱基的脱氨基反应有关。常见的脱胺反应包括5-甲基胞嘧啶→胸腺嘧啶、胞嘧啶→尿嘧啶、腺嘌呤→次黄嘌呤反应。如甲基化CpGs是基因组中突变率最高的位点之一，同时也是C·G→T·A突变模式的主要影响因素。与这一现象相一致的是NpCpG位点的C·G→T·A突变是两个最常见的突变模式1A 和1B的特征，其在至少25种不同的癌症类型均有发现[7]。外源性的物理或化学因素也可导致DNA损伤，如非电离的紫外辐射能导致相邻的嘧啶核苷酸的共价修饰。这种修饰形成了嘧啶二聚体：嘧啶光产物及环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）。与紫外线照射有关的皮肤癌（例如鳞状细胞皮肤癌和恶性黑色素瘤）中也多见双嘧啶碱基位点的C·G→T·A 突变或是CC·GG→TT·AA突变。

DNA修复过程中也能导致DNA损伤，如碱基切除修复（BER）中，当DNA糖基化酶识别损伤位点后会水解裂解和移除改变的碱基，从而产生无尿或无嘧啶位点。未修复的无尿或无嘧啶位点在复制过程中很容易引入错误的碱基，从而引起突变。核苷酸切除修复（NER）是一种非特异性的修复过程，当检测到大量的DNA 畸变时，例如苯并芘（BaP）和黄曲霉毒素等芳香胺引起的大量加合物以及铂类化合物、补骨脂素和UV诱导的损伤等，都会激活这种修复过程。转录偶联修复是典型的DNA修复类型，这种修复机制将导致转录链上的DNA损伤修复效率比非转录链更高。因此，在某些突变模式中出现转录链差异。复制后错配修复（MMR）系统可以识别和修复错误的碱基，以及在DNA复制和DNA重组修复活动中出现的错误。因此，MMR通路的缺陷增加了自发突变率，MMR相关蛋白的突变则影响基因组的稳定性并导致微卫星DNA 不稳定性增加。虽然NMR 相关的碱基突变特征目前还没有确切研究，但是在原发性癌症中发现NpCpG位点处的C·G→T·A以及CpCpC位点处的C·G→A·T均与MMR缺失相关。除此之外，MMR基因缺陷相关的癌症中出现大量的1-bp 插入突变，这一突变引起微卫星DNA 不稳定性。由于人类基因组非常庞大，DNA合成过程中即使很低的错误率也会导致大量的突变，使得DNA复制错误也是突变产生的机制之一。高保真度B族DNA聚合酶Polδ和Pol ε由于具有校对功能，其每个碱基的合成错误率在1/107。体细胞和生殖细胞中Polε的突变与结直肠癌和子宫内膜癌有关的突变特征10相关，显著表现为TpCpG 位点的C·G→A·T和C·G→T·A突变。另一导致复制过程中碱基错配的因素是细胞中三磷酸脱氧核苷酸含量的失衡。在癌症发展过程中，细胞周期调控失常导致对dNTP的需求增加。dNTP储备的失衡可能导致插入-切除循环、碱基错配以及校对效率，从而产生突变。

通过对9T 肿瘤中基因组序列的267192 个A-T 替换位点发现，突变腺嘌呤核苷酸位点两侧胞嘧啶核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸（即突变位点为C|T]A）以及鸟嘌呤核苷酸（突变位点为AG）高表达。与此一致的是，在16种可能的A-T突变三核苷酸组合中，马兜铃酸引起的TAG和CAG最为常见。除了侧翼序列（即+/-1）之外，位于+/-2位点的核苷酸也可能影响马兜铃酸的突变选择性。例如C|TAG序列特征在其他非马兜铃酸引起的肿瘤中并未发现，说明其是马兜铃酸引起的突变的特异性特征。研究发现在马兜铃酸引起的A-T突变位点（TA 及CA）中5′端+2 位腺嘌呤核苷酸高表达（即ATA 及ACA）3′端-2 位以鸟嘌呤核苷酸常见（即AGG）。因此，马兜铃酸引起的A-T突变的主要序列特征为A[C|T]AGG，这一特征也在AA-UTUC外显子中得以验证[8]。目前认为马兜铃酸引起的T∙A→A∙T 颠换与DNA复制过程相关，同时这一突变具有转录链偏差效应，即转录链出现的突变率相较非转录链要低，这是由于DNA的转录偶联修复机制，这种修复机制导致转录链上的DNA损伤修复效率比非转录链更高[7,8]。

2 突变与致癌过程

肿瘤发生与发展基于遗传信息突变的。在正常情况下，这些突变在组织中也会发生，并在组织间与物种间变化与传递。当细胞分裂期间发生自发遗传过程的错误时，其内部许多修复机制与系统可以进行校正，足以应对这样的突变频率。只有当损害持续并且到达产生肿瘤的阈值点才会导致肿瘤的发生。从这个意义上讲，人类的肿瘤或癌症可视为一种遗传性疾病。

2.1 致癌过程

肿瘤发生是多因素或多病因、多步骤、多年份、多基因和多途径的，也即多特征的。化学致癌作用步骤至少涉及三个重大步骤：“触发”、“启动”和“进展”（图1）。传统上只用形态学特征来表征，但在触发阶段，分子毒理学水平的评价更为敏感和重要。

图1 化学致癌作用过程的关键步骤

图2 AAs-DNA加合物的结构

显然，马兜铃酸类化合物（AAs）进入体内，经过活化产毒，生成相应的活性中间体，与DNA 反应形成加合物，DNA 加合物有多种结构，代谢活化的AAs 与DNA 中嘌呤碱基的环外氨基形成AAs-DNA 加合物，如dA-AAI、dG-AAI、dA-AAII、dG-AAII（图2）。DNA加合物聚集导致碱基突变，具体如AAI，先通过硝基还原反应和环化反应，将其转化为N-羟基马兜铃酸（AL-NOHs）。然后形成具有非定域正电荷的亲电性的环氮鎓离子中间态。中间态优先结合DNA 中嘌呤碱基的环外氨基形成AAI-DNA 加合物，分别为dAAAI和dG-AAI，可促进基因腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）的突变转换，即AT→TA，如果受损伤的DNA未被完全修复或修复发生错误，会发生DNA 突变，DNA 突变如果被放大到一定水平，使肿瘤抑基因TP53突变失去正常功能，从而使细胞增殖增强、分化异常，最终导致肿瘤的发生。TP53突变和AAs代谢产物-DNA加合物的形成被认为是一个阶段性标志，相应的指标也就成为评估AAs暴露及突变特征的生物标志物。在上述过程中，醌氧化还原酶（NQOI）在肝和肾的AAs代谢活化中起着非常重要的作用，催化AAI 产生还原性环氮鎓离子[9]。环加氧酶（COX）也能催化AAI-DNA加合物的形成。马兜铃酸I（AAI）和马兜铃酸II（AAII）是主要毒性成分。以AAI 为例，AAs 致癌过程的关键步骤的差异主要涉及到生物转化过程的参与。该生化过程包括AAI的活化、AAI-DNA加合物生成、DNA多位点突变。

2.2 肝脏代谢与转运功能对AAs致癌作用的影响

2.2.1 总体暴露与一般规律

尽管近来有报道说AAs说可以造成人体肝癌[10,11]，但总体上，大量的流行病学证据表明，马兜铃酸的主要靶向组织器官被公认为泌尿系统（表2）。马兜铃酸在体内暴露并非均一，肾脏有明显的富集作用[12]。经口服途径暴露后，肾脏中的检出暴露量是肝脏以及其它组织的两倍以上。

表2 暴露于马兜铃酸（AA）个体的肾组织中DNA加合物（dA-AAI）水平

如图3 所示，代谢活化是主要化学诱变致癌的机制。在肝细胞、肾细胞、肠细胞等的平滑内质网中富含细胞色素P450 单加氧酶系（Ⅰ相代谢酶系）。这些细胞色素P450单加氧酶将活性、极性基团引入致癌物的结构中，活化了致癌物，生成具有强亲电性质的物质，从而引发DNA 加合物的形成。II 期反应由肝内和肝外内质网中的UGT、SULT、COMT 等将强亲水性基团结合覆盖于活化的官能基团上，将降低毒性，增加水溶性，经过体内转运体作用，再经尿液、胆汁等排出体外。对于II 相酶活性较低的人群（如儿童、老年人，或者因疾病、遗传、饮食或种族等因素所致II相酶活性降低）[13],致癌物的高暴露风险将会增加（图4）。

马兜铃酸的代谢表现出很大的个体差异，也就是并非所有暴露个体均会产生致癌作用。由于AAI 是AAs 中主要致癌物质，比较倾向性的是AAI 代谢催化酶的高低是引发个体敏感性差异的原因之一。与上述一般机制一样，主导AAs 毒性活化的催化代谢酶被认为是NQOI 和COX[14]。比较有争议的是肝脏CYP 还原酶（CRP）与P4501A（1A1与1A2）的催化作用。

图3 AAs的生物活化和DNA加合物形成的途径

图4 基因毒和非基因毒性事件对致癌过程

2.2.2 AAs代谢作用的争议

早期的体外研究认为，AAI在经肝脏CYP1A1/2去甲基化的过程是毒性激活过程，但近期体内外研究已经基本确立肝脏CYP1A1/2 去甲基化的过程是AAI 的解毒过程。如使用肝脏CYP 还原酶缺失（Hepatic cytochrome P450 (Cyp) Reductase Null，HRN）小鼠（其中，肝细胞中NADPH 依赖性Cyp 氧还酶被敲出）、Cyp1a1((-/-))、Cyp1a2((-/-))两个单敲出小鼠、Cyp1a1/1a2((-/-))双敲出小鼠[15]、以及人源性CYP1A导入小鼠，这些研究最终证实小鼠与人肝CYP1A（包括1A1 与1A2）是解毒作用，而CRP 仍然是毒性激活作用。另外，肝脏还有另一种毒方式，通过II相代谢将AAs磺酸化，再通过MRP 的协同外排作用，减小肝内暴露。这些可以解释为何肝脏开始接触AAs量较肾脏如此之大却能够幸免于难。

2.2.3 转运体的作用[16]

转运体的影响不可小视，至少涉及到肝肾两个脏器的转运体。比较粗放的研究结论说，AAI 经过磺酸化作用被MRP 排至血液、转运至肾脏，由肾脏OAT 摄入而富集于肾脏与肾小管内从而造成肾脏的高暴露。这里有两个重要问题，被磺酸化后的AAI 结合物其DNA 结合作用到底是否减低？是磺酸化结合物分解后造成高暴露？两个脏器都是富含转运体的脏器，但这些转运体，但还有哪些转运体参与了这个转运或者富集或者排泄过程？一般想定是转运体间的微妙差异会决定两者不同的暴露及最终命运？但这个作用到底有多么重要。这个方面的研究还相当欠缺，其中没有好的同时导入多转运体的活体模型是一个关键或重要原因。

近期国内许多研究团队证明在幼鼠中可以诱导出肝癌[10,11]，但在成年鼠中比较难以获得致癌结局。作者斗胆猜测与幼鼠的CYP活性过低、磺酸化酶与转运体等发育不全有关。当然，作者建议，如再次进行相关研究时，需要严密监控相关代谢与转运机制或有意设计相关模型来证实和排除作者的猜测。这个领域的研究对帮助我国学者树立本学科的前沿与领先地位可能带来机遇。