UPLC-MS/MS同时测定鱼腥草中3个马兜铃内酰胺类成分的含量△

武营雪，康帅，刘静，戴忠，马双成

中国食品药品检定研究院，北京 100050

鱼腥草为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordataThunb.的新鲜全草或干燥地上部分[1]，又名折耳根，主要分布于我国中部、东南及西南各省。其味辛、性寒，具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋等功效。鱼腥草中含有挥发油、黄酮和生物碱类等成分，具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒等多种药理活性[2-5]。其中生物碱类成分有70 多种，主要包括阿朴菲型生物碱、马兜铃内酰胺生物碱、酰胺类生物碱、吡啶类生物碱和其他类生物碱[6]。2017 年，一项马兜铃酸及其衍生物与肝癌相关的研究引起了人们对马兜铃酸类成分的广泛关注[7]。马兜铃酸类成分为结构相似的一类物质，包括各种马兜铃酸和马兜铃内酰胺类成分。马兜铃酸在体内代谢可产生马兜铃内酰胺，自然界中也存在马兜铃内酰胺类成分[8]。

目前研究发现，马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ具有明确的肾毒性和致癌性，但对于马兜铃内酰胺类成分的安全性研究还不充分[9-11]。Chan 等[12]利用高灵敏度和高选择性的液相色谱-质联法（LC-MS/MS）未在鱼腥草中检出马兜铃酸Ⅰ和马兜铃酸Ⅱ（检出限为2 ng·g-1）。陈宏降等[13]发现，鱼腥草地上部分、鱼腥草根茎、三白草地上部分和根茎95%乙醇提取物对斑马鱼成鱼和胚胎具有一定的急性毒性和胚胎发育毒性，半数致死量（LD50）分别为2.85、10.40、2.54、1.19 mg·L-1，致畸的主要表现为心包水肿和卵黄囊水肿；同时研究发现马兜铃内酰胺AⅡ和三白草内酰胺0.5 mg·L-1可导致斑马鱼胚胎肾包膜水肿。研究者从鱼腥草中分离出马兜铃内酰胺BⅡ、马兜铃内酰胺AⅡ、马兜铃内酰胺FⅠ、马兜铃内酰胺FⅡ和胡椒内酰胺B、胡椒内酰胺D 等马兜铃内酰胺类成分，但是对于其含量和毒性的研究都比较缺乏[14-17]。

本研究采用超高效液相色谱-质谱法（UPLCMS/MS）对不同产地野生或种植的鱼腥草中3 个马兜铃内酰胺类成分进行含量测定研究，为鱼腥草中马兜铃内酰胺类成分后续安全性研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC MS-8050 型超高效液相色谱-质谱仪（日本岛津公司）；KQ-300DA 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Mili-Q 型纯水仪（美国密理博公司）；Sartorius MSA6.6S-CE 型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；XS105 型电子分析天平（瑞士梅特勒公司）；11B S025 型粉碎机（德国IKA公司）。

1.2 试药

对照品马兜铃内酰胺A Ⅱ（批号：X27S11L-125977，纯度：98%）、马兜铃内酰胺FⅠ（批号：X09M11-L112632，纯度：98%）、马兜铃内酰胺BⅡ（批号：X09M11-112631，纯度：97%）均购自上海源叶生物科技有限公司；甲醇（美国Fisher Chemical公司）；乙腈（德国Merck 公司）；甲酸（赛默飞世尔科技有限公司）。

鱼腥草药材购自河北安国中药材市场、安徽亳州药材市场和四川成都，共14 批，编号分别为S1～S14，见表1。经中国食品药品检定研究院中药所中药标本馆康帅副研究员鉴定为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordataThunb.的干燥地上部分。

表1 鱼腥草样品信息

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

取鱼腥草样品粉碎，取约0.20 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min（300 W，40 kHz），放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，放置30 min，取上清液，0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2 对照品溶液的制备

取对照品马兜铃内酰胺AⅡ、马兜铃内酰胺FⅠ和马兜铃内酰胺BⅡ适量，精密称定，加甲醇制成含马兜铃内酰胺AⅡ111.7 μg·mL-1、马兜铃内酰胺FⅠ72.9 μg·mL-1和马兜铃内酰胺BⅡ269.7 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱为Agilent SB-C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），以乙腈-0.1%甲酸（31∶69）为流动相，流速为0.3 mL·min-1，柱温为30 ℃，进样体积为1 μL。

2.4 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），采用多反应监测（MRM）模式，雾化气流速为3 L·min-1，干燥气流速为9 L·min-1，加热气流速为10 L·min-1，加热模块温度为400 ℃，脱溶剂管温度为250 ℃，离子源温度为300 ℃，正离子采集模式，待测化合物质谱检测参数见表2，混合对照品及样品离子流色谱图见图1。

图1 混合对照品溶液和鱼腥草供试品溶液的离子流图

表2 待测化合物质谱检测参数

2.5 方法学考察

2.5.1线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液适量，加甲醇溶液稀释至不同质量浓度，摇匀，制得系列混合对照品溶液，依2.3和2.4项下的色谱及质谱条件进样分析，以定量离子峰面积（Y）对分析物质量浓度（X）进行线性回归，绘制标准曲线。结果表明，各成分在各自的线性范围内具有良好的线性关系。将混合对照品溶液进一步稀释，以信噪比（S/N）=10 的进样质量浓度为定量限（LOQ），以S/N=3 的进样质量浓度为检测限（LOD），结果见表3。

表3 鱼腥草中3个马兜铃内酰胺成分的回归方程、线性范围、LOD、LOQ

2.5.2精密度试验 取编号为S14 的样品，按2.1项下方法制备供试品溶液，按2.3和2.4项下色谱及质谱条件进行测定，连续进样6 次，连续3 d 进样，测得各成分的峰面积，计算日内精密度和日间精密度的RSD。结果表明，马兜铃内酰胺AⅡ、马兜铃内酰胺FⅠ和马兜铃内酰胺BⅡ的日内精密度RSD分别为2.66%、0.79%和0.73%，日间精密度RSD分别为3.35%、1.79%和0.85%。结果表明该仪器及方法的精密度良好。

2.5.3稳定性试验 取编号为S14 的样品，按2.1项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h 按2.3 和2.4 项下色谱及质谱条件进行测定，测得各成分峰面积的RSD。结果表明，马兜铃内酰胺AⅡ、马兜铃内酰胺FⅠ和马兜铃内酰胺BⅡ峰面积的RSD 分别为2.56%、0.73%和0.83%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.4重复性试验 取编号为S14 的样品，按2.1项下方法制备6 份供试品溶液，按2.3 和2.4 项下色谱及质谱进行条件测定，每份进样3 针，测得各成分的平均含量和RSD。结果表明，马兜铃内酰胺AⅡ、马兜铃内酰胺FⅠ和马兜铃内酰胺BⅡ的平均质量分数分别为2.964、2.364、9.718 μg·g-1，RSD 分别为3.94%、5.36%、4.41%，该方法重复性良好。

2.5.5加样回收率试验 精密量取对照品适量，配制成一定质量浓度的混合对照品溶液，取已知含量的S14样品9份，每份约0.1 g，分成3组，分别精密加入相当于样品中各成分质量分数80%（低）、100%（中）、120%（高）的混合对照品溶液，按2.1项方法下制备供试品溶液，按2.3和2.4项下色谱及质谱进行条件测定，每份进样3 针，测定各成分的峰面积，并计算3个马兜铃内酰胺类成分的平均回收率，结果见表4，加样回收率为83.77%～105.61%，RSD 为1.14%～11.46%，符合方法学要求。

表4 鱼腥草中3个马兜铃内酰胺类成分加样回收率结果

2.6 样品含量测定

取不同批号的样品0.2 g，精密称定，按2.1 项下方法制备供试品溶液，按2.3和2.4项下色谱及质谱条件进行测定，每份进样3 针，测定各成分的峰面积，计算鱼腥草中3 个马兜铃内酰胺类成分的含量，结果见表5。

表5 鱼腥草中3个马兜铃内酰胺类成分质量分数（,n=3）μg·g-1

表5 鱼腥草中3个马兜铃内酰胺类成分质量分数（,n=3）μg·g-1

2.7 数据处理与分析

2.7.1箱线图和差异性分析 采用SPSS 26.0 数据处理软件对测定结果进行处理，对14 批鱼腥草中3个马兜铃内酰胺类成分含量进行分析，绘制箱线图（图2）。结果表明，样品S13（湖北野生）中3 个成分的含量较高；其余样品中马兜铃内酰胺AⅡ质量分数为0.757～14.692 μg·g-1；马兜铃内酰胺FⅠ质量分数为1.418～10.305 μg·g-1，马兜铃内酰胺BⅡ质量分数为2.893～28.339 μg·g-1。

图2 鱼腥草中3个马兜铃内酰胺类成分质量分数的箱线图

采用SPSS 26.0数据处理软件，单因素方差分析的方法对鱼腥草种植（10批）和野生（4批）样品中3个马兜铃内酰胺含量进行差异性分析，差异无统计学意义；对5个不同省份产鱼腥草样品中3个马兜铃内酰胺含量进行差异性分析，差异无统计学意义。

2.7.2聚类分析 将14批不同来源鱼腥草样品3个马兜铃内酰胺成分的含量数据导入SPSS 26.0 统计软件，选用组间联接聚类方法，以欧氏平方距离法进行系统聚类分析，结果见图3。当欧氏平方距离为25 时，所有样品首先聚为两大类，S13（湖北野生）聚为Ⅱ类，其余13 个样品聚为Ⅰ类；当欧氏平方距离为4 时，Ⅰ类可分为2 个小类，S11（四川种植）样品聚为Ⅰb 类，其余样品为Ⅰa类；当欧氏平均距离为2 时，Ⅰa 类可分为2 类，S2（湖北恩施种植）、S4（湖北十堰种植）和S8（四川广汉种植）为一类，其余样品为另一类。

图3 不同来源鱼腥草中3个马兜铃内酰胺含量聚类分析

2.7.3主成分分析（PCA）将14批样品中3个成分含量的平均值为变量，导入SIMCA-P 14.1软件进行PCA，前2个主成分累积方差贡献率为98%，其中第一主成分（PC1）方差贡献率为95.5%，第二主成分（PC2）方差贡献率为2.47%，见图4，图中每个点代表1个样品，与聚类分析的分类结果基本一致。

图4 不同来源鱼腥草中3个马兜铃内酰胺含量PCA

2.7.4相关性分析 利用SPSS 26.0 对3 种成分含量的相关性分析，结果见表6，马兜铃内酰胺BⅡ、马兜铃内酰胺FⅠ和马兜铃内酰胺AⅡ的含量之间存在显著相关关系。

表6 鱼腥草中3种马兜铃内酰胺成分相关性分析

3 讨论

3.1 色谱、质谱条件的选择

分别考察了乙腈-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液（含5 mmol·mL-1乙酸铵）流动相系统，结果发现不加乙酸铵的溶剂系统灵敏度高，色谱峰型好。本实验用UPLC-MS/MS 对马兜铃内酰胺类成分定量，均采用MRM 模式。将3个马兜铃内酰胺分别在正、负离子模式下检测，待测物在正离子模式下更稳定、灵敏度更高；在正离子模式下检测，同时获取母离子和子离子信息，并且优选出最佳碰撞电压。与紫外检测器相比，MRM模式灵敏度高，适合于微量物质的分析。

3.2 马兜铃内酰胺质谱裂解分析

根据质谱裂解规律，马兜铃内酰胺AⅡ的最佳离子对为m/z266→251，为[M-CH3+H]+峰，定性离子m/z195为[M-CH3+H-2CO]+峰；马兜铃内酰胺FⅠ与马兜铃内酰胺AⅡ是同分异构体，定量离子与定性离子相同；马兜铃内酰胺BⅡ的最佳离子对为m/z280→264，为[M-CH4+H]+峰，定性离子m/z236 为[M-CH4-CO+H]+峰；以上的质谱裂解特征是UPLC-MS/MS 定量分析识别检测成分的信号特征，构成采用UPLC-MS/MS 检测马兜铃内酰胺类成分的理论基础[18]。

3.3 鱼腥草中马兜铃内酰胺生物碱含量相关性分析

经差异性分析鱼腥草中马兜铃内酰胺生物碱含量发现，含量与鱼腥草的产地、野生或种植无关，可能与采集时间、储藏条件和植株高度等其他影响因素有关；聚类分析和PCA 结果一致，收集的14个样本中湖北野生（S13）各成分含量最高；相关性分析表明，3个成分的含量之间呈显著正相关，能够为其后续质量控制指标的选择及兼顾经济适用性方面提供参考。

本研究建立UPLC-MS/MS 测定鱼腥草中3 个马兜铃内酰胺含量的方法，发现14 批鱼腥草样品中马兜铃内酰胺AⅡ、马兜铃内酰胺FⅠ和马兜铃内酰胺BⅡ质量分数分别为0.757～19.538、1.418～15.971、2.893～70.131 μg·g-1，为后续鱼腥草中马兜铃内酰胺类成分的安全性研究提供参考。该方法简便、快速、灵敏、专属性强，可为其他药用植物中马兜铃内酰胺类成分的测定提供参考。