龙胆泻肝丸中马兜铃酸I 的液质联用法检测分析＊

刘 静，刘 汇，姚令文，戴 忠＊＊，马双成＊＊

（1.中国食品药品检定研究院 北京 100050；2.延边朝鲜族自治州食品药品检验所 延吉 133002）

研究发现部分马兜铃酸类化合物具有肾毒性、致癌致突变作用，对人体危害大，其安全性问题首次引起广泛关注与重视是在1993年，比利时学者在《柳叶刀》（Lancet）杂志报道了布鲁塞尔地区有女性在服用含中草药减肥药后导致严重肾病事件[1]。随后，多个国家和地区报道了类似病例，且后续追查确证了马兜铃酸类成分为致病成分，并相继禁止使用含马兜铃酸类成分的药用植物和制剂[2-8]。我国自2003 年以来采取了一系列风险防控措施，其中包括取消关木通、广防己和青木香的药用标准，并分别用木通、防己和土木香替代使用。

2017 年10 月，科学杂志的子刊转化医学杂志（Science translational medicine）刊出“台湾及亚洲地区肝癌发病与马兜铃酸及其衍生物高度相关”的研究论文[8]，再次引发公众对于含马兜铃酸成分中药安全性的热议及媒体的广泛关注[9]。为进一步查清目前市场上相关产品的质量状况，为掌握是否仍然存在以禁用品种替代使用或者混用的问题，本研究选取曾因处方中关木通导致马兜铃酸肾病事件的龙胆泻肝丸为筛查品种，作为一种常用中药复方制剂，本品具有清肝胆，利湿热的功效，用于肝胆湿热，头晕目赤，耳鸣耳聋，耳肿疼痛，胁痛口苦，尿赤涩痛，湿热带下；其用药历史悠久，历版中国药典均有收载，现行标准收载于《中华人民共和国药典》（2015 年版）一部，其处方由龙胆、柴胡、黄芩、栀子（炒）、泽泻、木通、盐车前子、酒当归、地黄和炙甘草十味药组成[10]。本研究旨在建立本品中马兜铃酸I成分的检测方法，以更好地保障用药安全性。

目前，马兜铃酸类成分检测分析方面的文献报道较多，检测技术涵盖薄层色谱法、液相色谱法、液质谱联用法和酶联免疫法等多种分析技术与方法，尤以液相色谱及液质联用技术应用最为普遍。其中，液相色谱法是《中华人民共和国药典》（2015 年版）一部细辛和天仙藤项下收载的马兜铃酸I 限量检查方法[11,12]，调研分析显示HPLC-UV 法适用于马兜铃酸类成分含量相对高、不存在干扰或通过适当前处理方式可排除干扰的中药品种[13,14]。液质联用法具有定性准确、灵敏度高、专属性强、不易受干扰等优势，目前已广泛应用于中药材饮片、中成药、保健品等不同样品中马兜铃酸成分以及不同基质中马兜铃酸-DNA加合物的检测与分析[15-25]。结合文献调研结果以及本品处方特点，本文首次研究建立了龙胆泻肝丸中马兜铃酸I的液质联用检测方法并对所有样品进行了筛查，为后续工作提供了基础数据与科学依据，更好地保障了人民用药安全。

1 仪器与试药

Agilent1260-6410B 液相色谱-质谱联用系统，安捷伦Mass Hunter 化学工作站；METTLER XS105 型、AE240 型电子分析天平；KQ-300DA 型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司；超声功率：300 W；频率：40 kHz）；Milli-Q超纯水处理系统。

马兜铃酸I 对照品（批号110746-201611，中国食品药品检定研究院）；乙腈（色谱纯，Fischer 公司），甲醇（分析纯，国药化学试剂有限公司），甲酸为质谱纯（赛默飞世尔公司），乙酸铵（HPLC 色谱纯，赛默飞世尔公司），水为超纯水。

龙胆泻肝丸共51批，来源于9家生产企业。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Agilent SB-C18 (2.1 × 50 mm，1.8 μm)；流动相：以乙腈为流动相A，0.1% 甲酸（含5 mmol·L 乙酸铵）溶液为流动相B，按下表中梯度程序洗脱（表1）；流速0.3 mL·min-1；进样量：1 mL。

2.2 质谱条件

电喷雾离子源（electronic spray ionization，ESI），正离子扫描，多反应监测模式（multiple reaction monitoring）；干燥气温度350℃；干燥气流速9 L•min-1；雾化气压力30 psi；源电压4000 V；马兜铃酸I保留时间为12.79 min，母离子m/z359.0，子离子m/z298.0（定量），m/z296.0（定性），裂解电压为70 eV，碰撞能量为5 V。

2.3 对照品溶液制备

精密称取马兜铃酸I 对照品适量，加甲醇制成2 μg·mL-1的对照品储备溶液，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

表1 梯度洗脱程序

2.4 供试品溶液制备

取本品水丸（6 g/袋）5袋，粉碎，取2 g；大蜜丸（6 g/丸）2丸，剪碎，加6 g硅藻土，研匀，取6 g；精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理（功率：300 W；频率：40 kHz）30 分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察

取对照品储备溶液，分别用甲醇逐级稀释，得到系列对照品溶液，分别进样1 ćL，记录峰面积。以质量为横坐标X，峰面积为纵坐标Y绘制马兜铃酸I的标准曲线并进行线性回归，结果马兜铃酸I 在20.0767~240.9204 pg 范围内线性关系良好，其回归方程为Y=17.333X-49.833（R2=0.9992）。

2.5.2 检出限和定量限

（1）仪器检出限和定量限

将对照品溶液稀释至不同浓度，进样测定，以信噪比3:1为检出限、10:1为定量限，测定结果分别为2.008 pg、6.024 pg。

（2）方法检出限（基质效应考察）

取阴性样品2 g，精密称定，置50 mL 具塞锥形瓶中，精密加入一定浓度马兜铃酸I对照品1 mL（50 ng·mL-1），精密加入甲醇24 mL，称重，超声（功率：300 W，频率：40 kHz）提取30 min，放冷，用甲醇补足失重，取续滤液，过0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。进样测定，以信噪比3∶1 为检出限，测定表明本品方法检出限为2.008 pg。

2.5.3 精密度试验

取同一龙胆泻肝丸溶液（No.10），按2.1、2.2 项下色谱与质谱条件重复进样6次，记录谱图。马兜铃酸I峰面积的RSD分别为1.6% ，表明精密度良好。

2.5.4 重复性试验

图1 HPLC-MS/MS筛查马兜铃酸I

分别取同一批龙胆泻肝丸（No.10）6份，精密称定，按2.4 法制备供试品溶液，按2.1、2.2 项下色谱与质谱条件进样测定。结果测得马兜铃酸I 的含量分别为2.03、2.05、2.11、2.20、2.14、2.26 mg·g-1，RSD 为3.61% ，表明方法重复性良好。

2.5.5 稳定性试验

取2.5.5 同一供试品溶液，分别于0、4、8、12、16、20、24h 测 定峰 面 积，马兜 铃酸I 峰 面 积 的RSD 为4.64% ，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.5.6 回收率试验

精密称取已测知马兜铃酸I含量的龙胆泻肝丸样品（水丸）1.0 g，置50 ml 具塞锥形瓶中，精密加入马兜铃酸I含量为2 mg·mL-1对照品溶液1 mL，精密加入甲醇24 mL，称定重量，超声处理30 分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.22 μm 微孔滤膜，平行制备6 份供试品溶液，进样测定，结果马兜铃酸I 的平均回收率为111.53% ，RSD为3.73% （表2）。

2.6 样品测定

51 批样品按2.4 项下制备供试品溶液，按2.1、2.2项下色谱与质谱条件进样测定，结果仅9、10号样品检出马兜铃酸I，检测结果分别为0.66 μg·g-1、2.13 μg·g-1；其余样品未检出，详见表3。

表2 加样回收试验计算结果

表3 样品检测结果

3 讨论

3.1 马兜铃酸I检测方法的选择

研究过程中首先尝试采用适用范围广的高效液相色谱法对龙胆泻肝丸中马兜铃酸I 进行检测，但由于本品处方所含药味多、成分复杂，存在其他成分干扰马兜铃酸I的情况，难以实现其准确检测与分析，因而进一步选择采用不易受干扰的液质联用技术对本品所含马兜铃酸I进行检测。

3.2 多反应监测模式离子对的选择

通过调研液质联用法检测马兜铃酸I 的相关文献[15-25]，结果显示主要采用正离子、多反应监测模式，母离子以m/z359为主，子离子有m/z298、296、324、268等。在实验过程中，经全扫描模式、子离子扫描模式优化质谱条件，结果发现碎片离子m/z298.0 丰度最强，其次为碎片离子m/z 296.0，因此选择m/z359.0-298.0离子对用于定量，m/z359.0-296.0离子对用于定性。

3.3 结论

研究结果显示，本次抽样9 家企业51 批次龙胆泻肝丸样品中，有2 批样品中检出马兜铃酸I，涉及1 家企业。由于本品处方中含有木通，不应检出马兜铃酸I，表明可能存在木通混入关木通的现象。鉴于马兜铃酸I对人体的危害性，针对本研究结果，已申请龙胆泻肝丸中马兜铃酸I 检查项补充检验方法，从而为后续工作提供基础数据与科学依据，以更好地保障人民用药安全。