橙皮素对阿霉素心脏纤维化的保护作用

王 敏 孙祖玥

（沈阳医学院，辽宁 沈阳 110000）

阿霉素（doxorubicin，Dox）是一种代表性的蒽环类抗生素，可用于多种实体瘤和非实体瘤的化学治疗，如乳腺癌、肺癌、白血病等。然而阿霉素的多种不良反应，特别是心脏毒性，严重限制其临床应用[1]。研究表明橙皮素具有扩张血管、抑制动脉粥样硬化发生发展等心血管保护作用[2]。本实验初步探讨橙皮素对阿霉素诱导的心脏纤维化的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物：SPF级雄性C57BL/6小鼠40只，体质量（22±2）g，购于辽宁省长生生物有限公司。在沈阳医学院动物实验室饲养。

1.2 主要试剂：橙皮素（Hesperetin，Hes），阿霉素均购于大连美仑生物有限公司。天狼猩红染色液试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司。Smad、pSmad抗体购自碧云天生物技术有限公司。

1.3 主要仪器：CM1250型冰冻切片机（德国徕卡）；western blot电泳仪及转膜装置（美国Bio-BAD）；低温高速离心机（德国，Eppendorf）；摇摆式混匀器（美国Thermo）

1.4 实验方法

1.4.1 阿霉素心脏毒性模型的建立方法：依据参考文献，采用小鼠腹腔注射阿霉素的方法建立阿霉素心脏毒性模型。操作方法如下：阿霉素组、阿霉素橙皮素组均按阿霉素3 mg/kg腹腔注射，每周1次，连续12周。观察小鼠体征变化，检测小鼠心力衰竭指标，出现心力衰竭样改变说明心肌受到损害。

1.4.2 动物分组：随机将40只雄性小鼠随机分为4组，即对照组、橙皮素组、阿霉素组、阿霉素橙皮素组，每组10只。对照组：按20 mL/kg腹腔注射生理盐水，每周1次，共12周；按10 mL/kg灌服0.5%羧甲基纤维素溶液，隔天1次，共12周。橙皮素组、阿霉素橙皮素组按30 mg/kg灌服橙皮素悬溶液（橙皮素粉末溶于0.5%羧甲基纤维素溶液中，灌胃前震荡混匀），隔日1次，共12周。处死小鼠，留取心脏制备组织切片，并制备左心室匀浆液，备检。

1.4.3 指标检测：采用天狼猩红胶原染色测定心脏胶原染色程度，采用western blot测定Smad、pSmad蛋白表达情况，严格按照试剂盒说明书的步骤操作。

1.5 统计学方法：天狼猩红染色图像、western条带通过Image-Pro Plus 6.0软件进行定量分析，用SPSS15.0软件进行统计，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果

由图1可见，与对照组比较，阿霉素组左心室纤维化区域明显偏大，胶原显著增大变粗，并且胶原含量明显增加，血管周围和间质纤维化明显；而阿霉素橙皮素组与阿霉素组相比，左心室纤维化区域明显变小，胶原形态也较细小，并且胶原含量较低。由图2可见阿霉素引pSmad表达的显著增加，而与阿霉素组相比，阿霉素橙皮素组具有较低的Smad蛋白磷酸化水平。

3 讨 论

橙皮素主要来源于芸香科柑橘属，来源广泛而且廉价，具有健胃、祛痰、利尿等功效[3]。现代研究表明其在抗心肌重构、抗心肌缺血、抗氧化等心血管保护作用方面具有较好的效果[2]。我们将橙皮素与化疗药物阿霉素联用，期望能够减轻阿霉素心脏毒性，为阿霉素心脏保护剂提供新的选择。

心脏纤维化是心脏疾病发生发展的重要环节，可导致心脏收缩和（或）舒张功能不全，最终发生心力衰竭[4]。心脏纤维化程度常能反应心力衰竭的发生发展情况。致纤维化分子机制包括转化生长因子β、血管紧张素Ⅱ、活性氧自由基、炎性因子等，其中转化生长因子β是目前已知最强致纤维化因素[4-5]。经典TGFβ通路包括与膜受体结合、Smad2/3磷酸化、与Smad4形成复合体、细胞核内基因表达[6]。本实验中检测了经典通路中Smad2蛋白的表达及其磷酸化水平。结果表明阿霉素组Smad蛋白磷酸化水平明显增加（P＜0.05），而橙皮素降低阿霉素诱导Smad蛋白激活。这一结果与天狼猩红胶原染色[7]结果是相符合的。这就说明橙皮素对阿霉素诱导的心脏纤维化具有一定保护作用，其机制可能与橙皮素抑制Smad蛋白激活有关。

图1 心脏天狼猩红染色

图2 左心室Smad、pSmad蛋白电泳