正交实验法优选咳喘合剂的提取工艺

娄成龙 王 莹 沈晓春 杜 静

咳喘合剂是杭州市红十字会医院的临床经验方，由蜜麻黄、蜜款冬花、蜜紫菀、浙贝、黄芩、前胡、甘草等12 味中药组成，具有宣肺平喘，止咳化痰的功效，临床用于小儿急慢性支气管炎、哮喘、过敏性咳嗽及上呼吸道感染、感冒后痒咳等症。为了规范咳喘合剂的提取工艺，确保制剂的疗效，根据处方中药物各组分的理化性质及药理特点，结合中医临床用药经验，采用正交实验法对咳喘合剂进行了提取工艺的优选研究，为咳喘合剂的制备提供依据[1-2]。

1 实验材料

1.1 仪 器 AL204 型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司)；R502B 型旋转蒸发仪（上海申胜生物技术有限公司）；SHB-Ⅲ-A 型循环水式真空泵（杭州大卫科教仪器有限公司）；HH6 型恒温水浴锅（金坛市江南仪器厂）；2F-1 型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；KQ-500DB 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；U3000 型美国戴安液相色谱（戴安中国有限公司）。

1.2 试 药 咳喘合剂（批号180711）；饮片：丹参（批号171108），甘草（批号170717），蜜紫菀（批号171221），黄芩（批号171112），桑白皮（批号171225），燀苦杏仁（批号170305），蜜款冬花（批号180615），焦六神曲（批号180529），前胡（批号180323），浙贝母（批号180328），炒紫苏子（批号161013），均来自浙江惠松制药有限公司；黄芩苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号110715-201720，纯度93.5%），甲醇、磷酸均为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 黄芩苷HPLC 含量测定方法的建立[3]

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18（4.6mm×250mm，5μm）；柱温：25℃;检测波长：280nm；流速:1.0mL/min；流动相：甲醇-水-磷酸（47：53：0.2）；进样量：10μL。

2.1.2 溶液制备 对照品溶液的制备：称取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为0.01857mg/mL 的黄芩苷对照品溶液。供试品溶液的制备：精密量取本品5mL，置100mL 容量瓶中，加70%乙醇适量超声处理（250W，40kHz）30min，放冷，定容至刻度，摇匀，精密量取续滤液1mL 置10mL 量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，经0.45un 的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 方法学考察

2.1.3.1 专属性试验 按咳喘合剂处方比例及工艺，同法制成不含黄芩的阴性样品，精密吸取黄芩苷对照品、供试品及阴性样品溶液各10μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样。结果表明阴性样品溶液无干扰，方法专属性良好。见图1-3。

图1 黄芩苷对照品高效液相色谱图

图2 咳喘合剂样品色谱图

图3 阴性对照色谱图

2.1.3.2 线性关系考察 精密吸取“2.1.2”项下黄芩苷照品溶液。逐级稀释共得5 份对照品溶液系列，浓度依次为：0.01857μg/mL、0.09285μg/mL、0.14856μg/mL、0.18570μg/mL、0.22284μg/mL，在“2.1.1”项色谱条件下，分别精密吸取上述对照品溶10μL 注入液相色谱仪。以峰面积（Y）对浓度（μg/mL，X）线性回归，回归方程：Y=3，502.536X-3.380，相关系数：R2=1.000，在0.01857～0.22284mg/mL 范围内，对照品的峰面积与进样浓度有良好的线性关系。

2.1.3.3 精密度实验 精密吸取“2.1.2”项下黄芩苷对照品溶液，重复进样5 次，按“2.1.1”项下色谱条件测定，测定黄芩苷RSD 为0.21%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.1.3.4 稳定性考察 取咳喘合剂（批号180711），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，于0，2，4，8，12，24h，按“2.1.1”项下色谱条件测定，黄芩苷RSD为0.46%（n=6），表明供试品溶液在24h 内基本稳定。

2.1.3.5 重复性试验 取同一供试品咳喘合剂（批号180711），按“2.1.2”项下的方法，制备6 份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定。结果表明，以黄芩苷为参照峰，各共有峰相对保留时间RSD＜1.34%，表明方法重复性良好。

2.1.3.6 加样回收率试验 取同一供试品咳喘合剂（批号：180711），按“2.1.2”项下的方法，制备6 份供试品溶液，分别加入一定量黄芩苷对照品，按“2.1.1”项下色谱条件测定。计算得平均回收率为100.73%，RSD 为1.38%（n=6），加样回收率良好。

2.2 出膏率的测定[4]精密量取各实验的咳喘合剂煎液适量置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3h，取出，置干燥器中冷却30min，迅速精密称定重量，计算出膏率。

2.3 正交实验设计[5-7]按处方比例称取蜜麻黄、蜜款冬花、蜜紫菀、浙贝、黄芩、前胡、甘草等药材共9份，每份106g，在预实验基础上，选取煎煮次数、加水量、煎煮时间和煎煮温度进行考察，各因素水平（见表1），采用L9（34）正交表安排实验，正交设计及正交试验结果（见表2），方差分析见表3。

表1 考察因素及水平

表2 正交试验表L9（34）及其试验结果

表3 方差分析

2.4 正交试验结果分析 由表3 可见，影响煎煮效果的因素顺序为：C＞D＞A＞B。选择偏差平方和最小的因素B（煎煮时间）为误差项，C（煎煮次数）有显著性差异，A（加水量）和D（温度控制）无显著性差异。综合分析得最佳煎煮工艺为A3B2C3D3，即加水量12（10，10）倍，提取时间1（0.5，0.5）h，提取3 次，100℃煮沸。考虑大生产的能耗问题及第3 煎的效价比，实际生产提取2 次，第1 次1h，第2 次0.5h，100℃煮沸，且由于加水量不是显著性因素，故实际生产加水量第1 次10 倍，第2 次8 倍，即优选煎煮工艺为A2B2C2D3。

2.5 验证试验 按优化的实验条件提取处方量的各味药材，按照优选的提取工艺条件进行3 次验证试验，测定黄芩苷含量和出膏率，结果见表4。

对验证结果要进行总结分析：由验证实验结果可知，黄芩苷平均含量为80.202mg/g，RSD 值0.79%；平均出膏率为30.47%，RSD 值0.57%。说明优选出的最佳工艺参数重现性好，工艺稳定。

表4 验证试验结果

3 讨论

咳喘方原为草药的水煎方，对小儿咳喘在临床上已取得良好的疗效。中药合剂可发挥中药的综合作用，吸收快、奏效迅速、可批量生产；既保留传统汤剂起效快的特点，又克服其服用、携带不便的缺点，省去临时配方和煎煮的麻烦，同时改善口感。咳喘合剂的制备选用水作为提取溶剂，可以最大程度保留原汤剂的煎药方式，同时还可以避免物质基础发生改变的风险。

由于咳喘合剂的服用人群是儿童，而该方中主要由苦杏仁、黄芩、浙贝等多种味苦的中药组成，加蜂蜜不仅可以调和口感，其补气益肺，润肺止咳的功效[8]也与咳喘合剂的主治功效相近，可以起到协同增效的作用，故用它作为矫味剂。同时，为了便于保存，在符合药典规定标准的前提下，选用了羟苯乙酯作为防腐剂，提高抑菌防腐的效力[9]。

在前期的预实验中，曾以君药麻黄[10]中的盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱，君药炒苏子中的迷迭香酸作为监测指标，但在成品中含量都很低，均低于万分之二；而黄芩中的黄芩苷在成品中含量较高，为确保实验数据的准确性，故以黄芩苷含量（mg/1g 黄芩饮片）为考察指标；此外，中药是通过组方配伍产生相应的功效，其有效成分复杂多样，故以出膏率作为优选工艺的另一个参考指标，进行数据分析，选出最佳煎煮工艺。

通过正交实验数据分析及结合生产实际，咳喘合剂的最佳制备工艺为处方饮片加水煎煮2 次，第1次1h，第2 次0.5h，加水量，第1 次10 倍，第2 次8倍，滤过，合并煎液浓缩，添加蜂蜜和羟苯乙酯，静置过夜，滤过，灌装，灭菌即得。验证试验结果表明，优选的工艺合理、稳定、可行，可用于咳喘合剂的生产制备。