大蒜素对大鼠肾间质纤维化干预作用及对肾组织TGF-β1/Smads 信号通路的影响

李希敏 徐 露 周 璐 邵田娱 梁珍珍

肾间质纤维化是各种致病因素引起的进行性肾损伤的主要病理特征，也是导致终末期肾脏病的共同进程，然而目前临床尚缺乏有效的治疗方法逆转这一过程。大蒜素化学名为二烯丙基三硫化物，是由大蒜经水蒸汽蒸馏而得到的一种挥发油，也可通过人工合成。近年来，国内外均有关于大蒜素对各类肾损伤的保护作用研究[1-2]。实验研究证明，大蒜素对心肌、肝脏以及肺组织纤维化具有抑制作用，因此推测大蒜素对肾脏的间质纤维化同样具有改善效果[3-4]。本研究采用单侧输尿管结扎术（UUO）制备大鼠肾间质纤维化模型，观察大蒜素对大鼠肾间质纤维化的干预作用，初步探讨其作用与TGF-β1/Smads 信号通路的关系。

1 实验材料

1.1 实验动物 雄性SD 大鼠18 只，清洁级，体质量（150±20）g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK（沪）2018-0006，于浙江中医药大学动物实验中心饲养，许可证号：SYXK（浙）2018-0012，实验动物伦理批件号ZSLL-2018-033，屏障环境，室温20～26℃，湿度40%～70%，自由食水，7 天后用于实验。

1.2 药品与试剂 大蒜素（98%，25g）：上海源叶生物科技有限公司（批号S25256）；Masson 染色液：南京建成科技有限公司（批号D026-1-2）；小鼠抗人转化生长因子-β1（TGF-β1）单克隆抗体：Santa Cruz公司（批号SC65378）；兔抗人磷酸化信号转导分子2（p-Smad2）单克隆抗体、羊抗人磷酸化信号转导分子3（p-Smad3）多克隆抗体、兔抗人α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）单克隆抗体：杭州华安生物技术有限公司（批号ET1702-34，ET1607-43，ET1609-41）；DAB 试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司（批号ZLI-9018）；HRP 标记羊抗鼠二抗、兔二抗：Proteintech 公司。

1.3 主要仪器与设备 STP120 脱水机、AP280-2 包埋机、HM335E 切片机：MICROM 公司；BG-270 隔水式电热恒温箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；蛋白电泳系统：Bio-Rad 公司。

2 实验方法

2.1 分组及肾间质纤维化模型建立 18 只SD 大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组与大蒜素组，每组6 只，采用UUO 建立大鼠肾间质纤维化模型。大鼠禁食24h 后，行腹腔麻醉，消毒，取左侧腹部切口，暴露左侧肾脏，用镊子分离出输尿管，于中上1/3 处结扎并剪断，致左肾完全梗阻，将肾脏置于原位后，逐层缝合大鼠腹壁。假手术组仅分离输尿管后直接缝合。

2.2 给药 自造模术后第1 天，大蒜素组大鼠予大蒜素60mg·kg-1·d-1灌胃处理，假手术组及模型组每天予等量生理盐水灌胃。第14 天，将所有大鼠放入代谢笼中，收集24h 尿液，随后将大鼠麻醉，经心脏取血，行肾脏原位灌洗去除血液，取下左肾并称重，将肾脏沿长轴剖开，一部分组织固定于10%中性福尔马林缓冲液，用于制备病理切片，另一部分保存于-80℃冰箱，用于蛋白质分析。

2.3 观察指标

2.3.1 体质量及肾脏指数 分别于造模后当天称量大鼠体质量，第15 天称量大鼠体质量及左肾质量，计算肾脏指数[肾脏指数=左肾质量（g）/体质量（g）×100%]。

2.3.2 血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）及24h 尿蛋白检测 采用尿蛋白试剂盒对尿液样本进行24h 尿蛋白定量测定，采用全自动生化分析仪测定血清样本的SCr 和BUN。

2.3.3 肾组织病理观察 对部分肾组织进行常规脱水，石蜡包埋、切片及Masson 染色，置于光学显微镜下观察肾间质的纤维化情况。

2.3.4 肾组织TGF-β1、α-SMA 检测 运用免疫组化法分析肾组织TGF-β1 及α-SMA 表达。方法：将石蜡切片放置60℃烤箱烘烤2h，脱蜡、水化，蒸馏水洗涤后，将切片浸入修复液，高压热修复，加入3%H2O2溶液10min，阻断过氧化物酶，PBS 洗涤5min，3次。加入一抗，37℃下孵育60min，PBS 洗涤后加入二抗，孵育60min，DAB 显色1～2min，复染，透明后封片。将切片置于光学显微镜下观察并扫描，借助Image J 图像分析软件，每张切片随机选取10 个视野（×400），计算平均光密度值（AOD）[AOD=累积光密度值（IOD）/阳性面积（Area）]，代表TGF-β1 和α-SMA 表达程度。

2.3.5 Western blot 分析 应用Western blot 法检测大鼠肾组织p-Smad2 和p-Smad3 表达量。方法：取-80℃留存组织剪碎后，超声粉碎，加入含有苯甲基磺酰氟（PMSF）的裂解液30min 提取对应蛋白，蛋白存储于-20℃冰箱。按照BCA 试剂盒步骤在96 孔板中加入试剂，酶标仪测算蛋白含量，用去离子水和5×loading buffer 配置成蛋白总含量为5mg/mL 的样品，100℃5min 水浴变性。在预制胶中加入每孔10μL的样品和预染marker，电泳100V，1h，转膜220mA，2h，封闭液封闭1.5h，敷一抗4℃摇床110rpm 过夜，洗膜10min×3 次，敷辣根过氧化物酶标记的二抗常温摇床40rpm 2h，洗膜3 次后，用ECL 显影剂曝光。运用Image J 软件分析每个条带的灰度值，与GAPDH 条带的比值作为相对表达量。

2.4 统计学方法 应用SPSS 22.0 软件处理数据，计量资料均以均数±标准差（±s）表示，组间差异比较采用单因素方差（One-way ANOVA）分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠体质量及肾脏指数比较 造模后当天三组大鼠体质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。造模后第15 天，模型组大鼠体质量显著低于假手术组（P＜0.05），肾脏质量及肾脏指数均显著高于假手术组（P＜0.01）；大蒜素组大鼠体质量显著高于模型组（P＜0.05），肾脏指数显著低于模型组（P＜0.01），与假手术组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

3.2 各组大鼠血SCr、BUN 及24h 尿蛋白比较 干预结束后模型组大鼠血SCr、BUN、24h 尿蛋白均显著高于假手术组（P 均＜0.01）；大蒜素组大鼠血SCr、BUN 及24h 尿蛋白均低于模型组（P＜0.05 或P＜0.01）。见表2。

表1 各组大鼠体质量与肾脏指数比较（±s）

表1 各组大鼠体质量与肾脏指数比较（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；大蒜素组：大蒜素60mg·kg-1·d-1 灌胃；假手术组与模型组：等量生理盐水灌胃

表2 各组大鼠血SCr、BUN 及24h 尿蛋白比较（±s）

表2 各组大鼠血SCr、BUN 及24h 尿蛋白比较（±s）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；SCr：血清肌酐；BUN：血尿素氮；U-TP：24h 尿蛋白；大蒜素组：大蒜素60mg·kg-1·d-1 灌胃；假手术组与模型组：等量生理盐水灌胃

3.3 肾脏病理观察 使用光学显微镜观察三组大鼠的Masson 染色切片，假手术组未见异常，模型组大鼠肾间质明显增宽，部分肾小管扩张、萎缩，存在大量蓝色纤维化灶，提示大鼠肾间质纤维化模型建立成功；与模型组比较，大蒜素组大鼠肾间质紊乱程度较轻，纤维化面积较小。见插页图1。

图1 大鼠肾组织病理观察（Masson 染色×200）

3.4 各组大鼠肾组织TGF-β1、α-SMA 蛋白表达量比较 假手术组大鼠肾组织TGF-β1 与α-SMA 蛋白免疫组化染色仅见少量棕色颗粒沉积，模型组棕色面明显增大，与模型组比较，大蒜素组阳性物质沉积相对减少。半定量法分析显示，模型组TGF-β1 与α-SMA 蛋白表达量显著高于假手术组（P＜0.01），大蒜素组TGF-β1、α-SMA 量显著低于模型组（P＜0.01），但高于假手术组（P 均＜0.01）。见表3、插页图2。

图2 大鼠肾组织TGF-β1 与α-SMA 表达（免疫组化DAB 染色×200）

表3 各组大鼠肾组织TGF-β1、α-SMA 蛋白表达情况比较（±s）

表3 各组大鼠肾组织TGF-β1、α-SMA 蛋白表达情况比较（±s）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；TGF-β1：转化生长因子-β1；α-SMA：α-平滑肌肌动蛋白；大蒜素组：大蒜素60mg·kg-1·d-1 灌胃；假手术组与模型组：等量生理盐水灌胃

3.5 各组大鼠肾组织p-Smad2、p-Smad3 蛋白表达量比较 模型组大鼠肾组织p-Smad2 与p-Smad3蛋白表达量高于假手术组（P 均＜0.01），与模型组比较，大蒜素组p-Smad2、p-Smad3 表达量较低（P 均＜0.01），但高于假手术组（P 均＜0.01）。见表4、插页图3。

图3 大鼠肾组织p-Smad2 与p-Smad3 表达（Western Blot）

表4 各组大鼠肾组织p-Smad2/3 蛋白表达量比较（±s）

表4 各组大鼠肾组织p-Smad2/3 蛋白表达量比较（±s）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；p-Smad2：磷酸化信号转导分子2；p-Smad3：磷酸化信号转导分子3；大蒜素组：大蒜素60mg·kg-1·d-1 灌胃；假手术组与模型组：等量生理盐水灌胃

4 讨论

肾间质纤维化是以过量细胞外基质（ECM）在肾间质积聚、肾脏组织结构破坏、功能丧失为主要特征的病理改变，临床上根据纤维化的进展程度分为三期，一旦进入纤维形成后期或瘢痕形成期，则难以通过治疗逆转。肾纤维化病理涉及炎症反应、氧化应激反应增强、肾脏固有细胞及免疫细胞的凋亡、促/抑纤维化细胞因子失衡等多个环节。研究证明，多种细胞因子对该过程具有调节作用，如转化生长因子-β（TGF-β）、血小板衍生生长因子（PDGF）、结缔组织生长因子（CTGF）能够促进细胞外基质（ECM）的积聚，而肝细胞生长因子（HGF）、骨形成蛋白（BMP-7）具有抑制作用[5]。

TGF-β1 的下游靶点涉及MAPKs、Smads、PKA、PKC、Ca2+等通路，以上各因子间相互调控，构成复杂的网络关系，其中Smads 蛋白作为中介分子，被认为在TGF-β1 信号传导至细胞核的过程中起到关键作用。研究表明，Smad2/3 参与ECM 合成与降解的相关基因的表达调控：TGF-β1 与TβRⅠ受体结合后，激活TβRⅡ受体的丝氨酸/苏氨酸激酶，使Smad2/3磷酸化，p-Smad2/3 与Smad4 形成活性的转录复合物进入核内，促进PAI-1 和Ⅶ胶原基因的表达，进而增加ECM 的合成并减少其降解[6-7]。α-SMA 是肌成纤维细胞的标志蛋白，其含量与组织纤维化程度直接相关[8]。

大蒜素是大蒜中主要生物活性成分的总称，国内外均有研究证明，大蒜素对不同致病因素导致的肾损伤具有保护作用[1-2]。另外，大蒜素能够对不同脏器组织的纤维化起到一定的改善作用。李少春等[9]通过实验证实，大蒜素能够减少心肌细胞TGF-β1 和Smad3 表达，促进Smad7 表达，减轻心肌纤维化的程度；曾玉兰[4]等研究表明，大蒜素通过下调TGF-β1和成纤维细胞α-SMA 的表达，从而干预大鼠肺纤维化的发生。本研究借助UUO 制备的肾间质纤维化大鼠模型，证明大蒜素干预能够减轻大鼠的肾间质纤维化程度，改善其肾功能，作用机制可能与降低TGF-β1 在肾组织表达，抑制Smad2、Smad3 磷酸化，从而减少ECM 的生成相关。