C 反应蛋白基因单核苷酸多态性与脓毒症易感性及严重程度的关系

唐玉霞 单国勇 狄君斐

脓毒症是一种由感染引起的危及生命的系统性炎症反应综合征[1]。炎症反应的程度与脓毒症的预后密切相关。C 反应蛋白（CRP）是脓毒症的重要生物标志物，可反映炎症反应和败血症的严重程度[2-3]。CRP基因的遗传变异在血管损伤中发挥作用，而血管损伤可能是脓毒症引起的微血管功能障碍的基础[4-5]。然而，CRP 基因多态性与脓毒症易感性和严重程度的相关性尚不明确。基于此，本研究探讨CRP 基因rs1205 位点和rs3093062 位点与脓毒症的易感性和严重程度之间的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014 年5 月—2017 年8 月期间浙江省台州市中西医结合医院普内科收治的125例脓毒症患者作为研究组，年龄23～75 岁，其中一般脓毒症患者72 例，急性生理与慢性健康评估II（APACH II）（16.54±4.47）分；严重脓毒症患者53例，APACH II（22.35±5.12）分。根据研究组患者的年龄、性别等匹配招募同期健康体检者125 名作为对照组。本研究经医院伦理委员会审核通过，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：（1）符合2001 年美国危重病医学会/美国胸科医师学会制定的脓毒症的诊断标准[6]；（2）年龄≥18 岁；（3）临床病历资料完整。排除标准：（1）年龄＜18 岁；（2）孕妇或处于哺乳期的妇女；（3）严重的脏器功能异常；（4）患免疫系统疾病；（5）肿瘤患者。

1.3 基因分型 所有受试者均抽取4mL 静脉血，其中2mL 采用EDTA 抗凝后使用天根生化科技（北京）有限公司的血液基因组提取试剂盒（DP318，规格：50次）提取基因组DNA，保存于-20℃冰箱。利用Primer 5.0 软件根据NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/term=）数据库中相应SNP 位点序列信息设计引物，引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。rs1205位点的引物序列为上游：5′-AGGGGACTCTTGGACAGGTT-3′，下游：5′-TTATGGACTTTGGGAGTGAGAC-3′；rs3093062 位点的序列为上游：5′-CAAACTCTATGATTTGGGCTGAAGT-3′，下游：5′-ACGAGTGGCCATCTGGGTG-3′。PCR 扩增体系为20μL，模板基因组DNA 25ng，10×PCR buffer 2μL，25mmol/L的Mg2+1.5μL，10μmol/L dNTP 1μL，10pmol/L 的上、下游引物各1μL，0.25μL DNA 聚合酶，用无菌水补足至20μL。PCR 反应条件为：95℃，5min；94℃，20s；60℃，30s；72℃，30s，35 个循环；72℃，5min；4℃保存。PCR 完成后将PCR 扩增产物纯化，然后将纯化产物送上海生工生工生物工程技术公司进行测序，结果见图1。

1.4 血清CRP 蛋白水平检测 将剩余的2mL 全血3000r/min 离心20min，取上清，保存于-70℃冰箱。血清CRP 检测试剂盒采用abcam 酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（货号ab99995，批号201403021）检测，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。

1.5 统计学方法 应用SPSS 20.0 软件进行数据统计，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t 检验，计数资料以频数[n（%）]表示，采用χ2检验。基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡采用χ2检验。采用χ2检验分析等位基因和基因型频率的差异，并估计比值比（OR）和95%置信区间（CI），P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

图1 CRP 基因rs1205 位点和rs3093062 位点测序结果

表1 CRP 基因rs1205 位点和rs3093062 位点基因型和等位基因频率[例（%）]

2.1 两组一般资料比较 研究组男81 例，女44 例，平均年龄（56.50±10.85）岁，体质指数（BMI）（23.42±2.73）kg/m2，有吸烟史56 例，有饮酒史75 例。对照组男78 例，女47 例，平均年龄（57.10±11.55）岁，BMI（23.67±2.08）kg/m2，有吸烟史52 例，有饮酒史81 例。研究组和对照组年龄、性别、BMI、吸烟史、饮酒史等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

2.2 CRP 基因单核苷酸多态性（SNP）与脓毒症易感性 CRP 基因rs1205 位点和rs3093062 位点基因型频率分布符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。CRP基因rs1205 位点基因型频率在研究组和对照组之间差异有统计学意义（χ2=6.64，P=0.04），该位点TT 基因型是脓毒症的危险因素（OR=3.02，95%CI=1.18～7.87，P=0.01），研究组rs1205 位点T 等位基因频率显著高于对照组（χ2=5.05，P=0.03），该位点T 等位基因是脓毒症发生的危险因素（OR=1.53，95%CI=1.04-2.25，P=0.03）。研究组和对照组CRP 基因rs3093062位点不同基因型频率之间的差异有统计学意义（χ2=18.30，P＜0.01），GA 和AA 基因型是脓毒症的危险因素（OR=2.68，95%CI=1.19～4.83，P＜0.01；OR=4.18，95%CI=1.59～11.29，P＜0.01），研究组rs3093062 位点A 等位基因频率显著高于对照组（χ2=19.51，P＜0.01），该位点A 等位基因是脓毒症的危险因素（OR=2.43，95%CI=1.60～3.70，P＜0.01），见表1。

2.3 CRP 基因多态性与性别、年龄的相关性 本研究中不同性别、年龄受试者CRP 基因rs1205 位点和rs3093062 位点基因型频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2-3。

2.4 CRP 基因多态性与脓毒症严重程度相关性不同严重程度脓毒症患者CRP 基因rs1205 位点和rs3093062 位点基因型频率之间比较，差异有统计学意义（P＜0.05），CRP 基因rs1205 位点TT 基因型患者的脓毒症较为严重，CRP 基因rs3093062 位点AA 基因型患者脓毒症较为严重，见表4。

表2 CRP 基因rs1205 位点和rs3093062 位点基因型与性别的相关性[例（%）]

表3 CRP 基因rs1205 位点和rs3093062 位点基因型与年龄的相关性[例（%）]

表4 CRP 基因rs1205 位点和rs3093062 位点基因型与脓毒症严重程度相关性[例（%）]

2.5 CRP 基因多态性与血清CRP 水平的相关性检测受试者血清CRP 蛋白水平，结果显示，研究组患者血清CRP 水平显著高于对照组，差异有统计学意义 [（75.46±23.54）mg/μL 比（5.24±1.17）mg/μL，t=33.31，P ＜0.01]。比 较CRP 基 因rs1205 位 点 和rs3093062 位点不同基因型受试者血清CRP 水平结果显示，CRP 基因rs1205 位点CC 基因型受试者血清CRP 水平最低，其次是CT 基因型，TT 基因型受试者最高[（24.53±9.17）mg/μL、（35.75±12.15）mg/μL、（71.24 ±18.45）mg/μL，F=65.34，P ＜0.01]。CRP 基 因rs3093062 位点GG 基因型受试者血清CRP 水平最低，其次是GA 基因型、AA 基因型最高 [（31.45±15.42）mg/μL、（47.98±13.54）mg/μL、（66.97±17.42）mg/μL，F=59.64，P＜0.01]。

3 讨论

CRP 是由肝细胞产生的急性期蛋白，CRP 蛋白水平与炎症反应、癌症、心脏病和糖尿病有关[7-9]。CRP 基因rs1205 位点SNP 位于CRP 基因的3’UTR区域，与许多疾病有关，包括牛皮癣、结肠直肠癌和糖尿病等[10-12]。rs3093062 位点SNP 位于CRP 基因的启动子区域，有研究显示，rs3093062 位点基因多态性与血浆CRP 水平有显著相关性[13]。

本研究结果显示，CRP 基因rs1205 位点稀有突变型等位基因是脓毒症的高危因素，且与疾病严重程度相关，分析不同性别、年龄受试者中rs1205 位点SNP 与脓毒症风险相关性，结果显示，不同性别、年龄受试者rs1205 位点SNP 与脓毒症风险不相关，表明性别、年龄对rs1205 位点SNP 无明显影响。进一步分析结果显示，rs1205 位点突变型患者血清CRP水平比野生型高。笔者分析原因认为，rs1205 位点位于CRP 基因的3’UTR 区域，该区域可能处于微小RNA（microRNAs）的靶点区域，突变可能影响microRNAs 对CRP 的表达调控作用，但还需要进一步研究证实。

本研究结果还显示，CRP 基因rs3093062 位点GA 和AA 基因型是脓毒症的危险因素，携带A 等位基因群体是脓毒症发生的高危群体。另外，不同性别、年龄受试者中rs3093062 位点SNP 与脓毒症风险也不相关，该位点SNP 也不受年龄和性别的干扰。进一步分析结果显示，CRP 基因rs3093062 位点突变型受试者血清CRP 蛋白水平较高，说明CRP 基因rs3093062 位点突变影响血清CRP 表达水平。分析原因，笔者认为rs3093062 位点位于CRP 基因的启动子区域，突变可能影响CRP 蛋白的表达调控，有研究显示，rs3093062 位点基因多态性与血浆CRP 水平有显著相关性[14]。此外，Ghaffari 等[15]研究rs3093062位点与冠心病发生风险相关性发现，rs3093062 位点GA 和AA 基因型受试者血清CRP 水平显著高于GG 基因型，与本研究结果一致。

然而本研究也有不足之处。首先，由于本研究样本量较小，为了验证本研究结论的准确性，可能需要进一步扩大样本量进行进一步研究。其次，CRP 基因rs1205 位点和rs3093062 位点位点均位于CRP 基因的非编码区，其突变与CRP 表达水平的相关性的具体机制需要进一步研究证实。

综上所述，CRP 基因rs1205 位点+1846C＞T 突变和rs3093062 位点-409G＞A 突变与脓毒症易感性及其严重程度相关。其机制可能与突变影响CRP 蛋白表达有关，还需要进一步扩大样本量进行研究。