间充质干细胞治疗克罗恩病肛瘘的研究进展

张国兴，石 荣，陈昌捷，梁瑞文

克罗恩病（crohn' s disease, CD）是一种发病机制尚未明确的慢性炎症性肠病，病变多位于回肠末端，主要临床症状是腹痛、腹泻和黏液脓血便。瘘管是其主要的肠道并发症之一，并且大部分为复杂性肛瘘，易反复，明显影响患者生活质量。已发表的流行病学研究[1-2]表明，至少26%的患者在诊断CD后的前20年内会并发肛瘘，尤其是病变位于结肠和直肠的患者。联合用药和手术在CD肛瘘(perianal fistulizing crohn' s disease, PFCD)治疗中具有很好的疗效，但并未达到瘘管长期愈合，并且不能充分改善患者的生活质量，常引起脓血症、肛门狭窄和失禁等并发症。因此，需要新兴和改进的治疗方法。间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）是一种非造血功能的多能干细胞，能够下调免疫反应并促进组织愈合，其在抗炎治疗、组织再生及自身免疫性疾病等方面的治疗作用已得到证实。近年研究表明，MSC在治疗PFCD方面具有一定的安全性和有效性，有广泛的应用前景。本文就MSC在PFCD治疗中的应用作一综述。

1 MSC的作用机制

MSC具有免疫调节和抗炎作用，抑制T细胞分裂增殖，阻断T细胞周期，使T细胞停留在G0/G1期[3]。MSC可抑制B细胞的增殖和分化[4-5]，对多能造血干细胞树突细胞（dendritic cell，DC）分化和树突状细胞的成熟也有一定的抑制作用[6-7]。MSC可影响DC的募集、成熟、迁移和活化T细胞的能力，诱导促炎性的M1型巨噬细胞转化为抗炎性的M2型巨噬细胞[8]。MSC可明显减少促炎因子如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）和白细胞介素-1β（interleukin-1β，1L-1β）的分泌，促进抗炎因子白细胞介素-10的表达[9]。MSC通过增加CD4+Th2淋巴细胞及CD4+，调节的T淋巴细胞的相对比例，从而抑制CD8+细胞毒性T淋巴细胞的活性，有利于促进促炎作用并抑制T淋巴细胞介导的免疫反应[10]。

MSC能选择性地迁移到组织损伤和炎症的部位[11-12]，帮助组织修复。有研究表明[13]，MSC在注射后停留在结肠中至少15天。MSCs被分化成各种细胞类型，进入损伤和炎症的组织中促进组织修复和黏膜愈合。目前尚未有关于MSC对PFCD的确切作用机制的研究，但从MSC在免疫调节过程中的作用来看，MSC能够抑制DC的成熟，间接地防止了T细胞的活化，亦能直接对T细胞起作用。同时能抑制NK细胞的细胞毒性，还对B细胞、单核巨噬细胞系统、补体系统、Treg等起作用。正是因为这些特点，MSC成为了治疗PFCD的新兴治疗手段。

2 MSC在PFCD治疗中的应用

2.1 MSC治疗PFCD的临床试验 目前已有11项Ⅰ～Ⅲ期临床研究[14-24]证实，MSC治疗PFCD的疗效和安全性（表1），超过半数患者达到完全缓解。3项研究[16,21,23]表明，与对照组相比，MSC治疗在6至24周和24至52周终点时，治愈率均明显提高。在治疗过程中，不良反应主要是肛周疼痛、肛周脓肿，无其他明显的不良反应发生。2018年的一项Meta分析和系统评价[25]表示，MSCs治疗PFCD的疗效明显优于对照组，且仅出现了轻度不良事件。总之，无论MSCs的来源、剂量和给药方式如何，研究结果均证实了MSC用于PFCD治疗的有效性和安全性。

2.2 临床应用MSC的来源 MSC来源广泛，可以从骨髓、脂肪组织、脐带、胎盘或大多数器官的结缔组织中分离[26-27]。在目前的研究中[14-15,21-22,28]，治疗CD肛瘘的细胞来源大多是脂肪组织，仅有2项研究[20,23]的细胞来源是骨髓组织，可能是由于脂肪组织在临床上相比骨髓组织更容易取得。Ribeiro等[28]学者研究表明，相比与脐带来源和骨髓来源的MSC，脂肪来源MSC对T细胞的免疫抑制作用最强。相反，Xishan等[29]表明，骨髓来源MSC对T淋巴的免疫抑制作用强于脂肪来源MSC。此外，Li等[30]证实，脂肪组织和脐血MSC对T细胞的抑制作用优于骨髓MSC。对于不同来源的MSC所带来的疗效和安全性的差异，仍需更多的临床研究加以证实。

自体细胞相比异体细胞而言，理论上具有较低的排斥性和较好的耐受性，但在治疗过程中，自体细胞的抽取会延缓治疗的进程，而异体MSC则避免了这个问题。目前，尚未有临床研究进行比较自体与异体细胞之间的愈合率。另外，有研究[31-32]表明，由于同种异体间充质干细胞具有较低的人白细胞抗原Ⅰ类表达水平，且缺乏Ⅱ类或共刺激分子（CD80，CD86或CD40），所以同种异体MSCs可能不会产生临床相关的抗体，阻碍后续使用的疗效。

2.3 MSC的临床应用剂量和频率 11项Ⅰ～Ⅲ期临床研究[14-24]的剂量和频率都不同。在Molendijk等[23]学者的研究中，局部注射10×106或30×106或90×106MSC进行临床比较，结果表明，最有效的剂量是30×106MSC。Cho等[17]的研究是基于瘘管长度注射9×10～12×107MSC，Lee等[18]学者的研究是Cho等学者研究的延伸。Lee等人发现，基于瘘管长度注射MSCs，第一次注射时的平均剂量为15.8×107MSC时，治愈率最佳。此外，在Panes等[22]的大型Ⅲ期临床研究表明，增加的细胞数量与瘘管愈合的速率无关。

目前尚无研究表明MSCs在炎症部位停留时间长短，有研究[33]发现，在MSCs注射的第5天，可在肠道炎症区域被检测到。也有研究[34-35]发现，MSCs在注射后第一周，肠道组织的追踪分析每次均能发现在肠道炎症区。总之，重复注射可能是有利的，未来的研究应该解决，在治疗过程中，重复注射MSCs或基于瘘管长度递送MSCs的数量，能否提高治疗效果。

2.4 MSC的临床应用途径 大量研究[14-23]证实，局部注射是治疗PFCD的有效途径。同时，自体MSC附着于可吸收的基质并置入瘘管，也是治疗PFCD的有效途径。2017年，Dietz等[24]的Ⅰ期临床研究是利用应用生物可吸收的基质吸附MSCs，递送至瘘管中。其原理的将脂肪组织提取的间充质干细胞进行培养，之后将细胞接种至生物支架上继续培养。等支架上增殖足够多的干细胞之后，将支架填充至瘘管内。研究结果表明，12名患者中，有9名在3个月内达到临床治愈，10名在6个月达到临床治愈。此外，也有研究[16]是利用肛瘘栓或纤维蛋白胶与MSCs结合递送到瘘管。2018年的Meta分析[25]中表示，MSCs与纤维蛋白胶结合注射的治愈率为71%，与肛瘘栓结合注射的治愈率为83%，直接注射的治愈率为50%。相比于直接注射而言，利用生物支架递送的方式会优于直接注射，这可能是因为生物支架材料能让MSCs停留在瘘管中。未来还需要更多的临床研究比较MSC不同的应用途径的疗效和安全性。

表1 MSC治疗CD并发肛瘘的临床试验

3 MSC治疗PFCD存在的问题和未来展望

总体而言，MSC治疗PFCD的安全性较高，2018年的Meta分析[25]中表示，大多数的不良反应是肛周脓肿、疼痛，无严重不良反应。其次，MSC的免疫调节机制极其复杂，其是否具有潜在的致癌作用目前尚未明确。一方面，干细胞具有癌基因激活、抑癌基因失活的典型肿瘤细胞特征，且MSC分泌的一些趋化因子可增加肿瘤细胞的增殖和转移。2018年的Ma[36]和Liu等[37]学者的动物研究表明，MSC可促进肿瘤的进展。另一方面，MSC可能减少肿瘤细胞在体内的凋亡。Ayuzawa等[38]研究表明，MSC可以明显减缓人乳腺癌细胞的生长速度，有望成为抗肿瘤治疗的新手段。在本次纳入的11项研究中，Portilla等[21]报道了1例子宫平滑肌瘤，但考虑到子宫平滑肌瘤为多因素共同作用的结果，所以该研究未揭示MSC治疗具有致癌风险。未来，在MSC治疗中的安全性仍需更多的临床研究加以证实。

再次，MSC技术方案方面使用自体组织还是异体组织、最佳剂量、局部注射还是附着于生物支架、注射的频率和间隔时间等问题，均需要循证医学证据来给出答案。为了确保MSC临床应用的规范性，亟需制订标准化的临床治疗方案。

最后，明确MSC治疗PFCD的确切机制，是未来需要解决的一个大问题，这将会优化未来治疗时的干预措施。

综上所述，MSC代表了复杂肛瘘的一种新型微创替代方案，可以减少PFCD患者对于系统性免疫抑制或手术的需求，同时避免了肛门失禁、狭窄等并发症。虽然在临床试验研究中肯定了MSC的疗效和安全性，但是由于研究之间对肛瘘的临床愈合标准不统一，存在明显的异质性，且缺乏治愈后的随访，对于术后复发的概率无统计学数据。在未来的研究中，尽量达成瘘管愈合的标准化定义及临床治疗的标准化方案。随着对MSC的不断探索，其生物学特点和免疫调节能力将为治疗PFCD提供新的思路和方法。