补肝健腰方对腰椎间盘突出症模型神经功能评分及IL-1表达的影响

谭旭仪，赵迪民，仇湘中，仇 杰，蒋盛昶，张信成，唐 皓

补肝健腰方功效为养血柔肝、活血化瘀、通络止痛，临床上用于腰椎退行性疾病及腰椎间盘突出症。前期实验研究发现，补肝健腰方降低腰椎间盘退变模型大鼠椎间盘核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信号通路，降低下游产物TNF-α、IL-1β、IL-6的表达[1-2]，达到对腰椎间盘退变的修复作用[3-4]。临床观察发现，补肝健腰方可降低腰椎间盘突出症（lumbar disc herniation，LDH）患者血清TNF-α浓度，具有安全、有效等优势[5]。本实验观察补肝健腰方对大鼠腰椎间盘突出症模型神经功能评分及IL-1表达的影响，探讨补肝健腰方对腰椎间盘突出症的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 3～4月龄清洁级健康SD大鼠100只，雄性，体重约180～220 g（湖南省中医药研究院动物实验室代购）。动物合格证SCXK（湘）2016-0012。

1.2 药物 （1）补肝健腰方，功效为养血柔肝、活血化瘀、通络止痛。药物组成：当归15 g，川芎12 g，白芍30 g，熟地25 g，炒枣仁10 g，杜仲15 g，延胡索10 g，蜈蚣4 g，全蝎3 g，甘草5 g。由湖南省中医药研究院附属医院药剂科提供，加水煎煮2次，制备含补肝健腰方生药，浓度约为2.15 g/mL。（2）塞来昔布胶囊（辉瑞制药有限公司，0.2 g/粒），药物批号16020101407。

1.3 试剂 IL-1免疫组织化学检测试剂（美国Santa Cruz有限公司） 。

1.4 分组 根据大鼠体重，随机分为正常对照组、假手术组、模型对照组、补肝健腰方组、塞来昔布组，各20只。

1.5 造模 大鼠腰椎间盘突出症动物模型制备方法参考自体髓核回植的方法[6]。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，俯卧位固定。将将背部、尾部术区常规备皮，消毒铺巾。先切取2个尾椎椎间盘，需包含上下软骨终板。用针刺破椎间盘上下终板，暴露髓核，并用7号手术线呈“米”形包绕椎间盘。手术切开皮肤，暴露L5/L6椎间隙及L5神经根，将预先准备包绕的尾椎椎间盘放入左侧L5神经根处，逐层缝合。假手术组大鼠手术暴露L5/L6椎间隙及L5神经根，不放置椎间盘。正常对照组不给予任何手术处理。术后连续3天将青霉素80万U/(kg·d)腹腔注射，预防感染。

1.6 干预方法 造模1周后，各组给与实验药物灌胃。具体剂量参照大鼠与人的等效剂量折算系数[7]，其中补肝健腰方组大鼠用含补肝健腰方生药浓度约为2.15 g/mL，灌胃剂量为11.61 g/kg，1次/d。塞来昔布组给与塞来昔布胶囊，0.34 g/kg。按照1 mL/200 g体重，取生理盐水溶解后灌胃，2次/d。正常对照组、假手术组、模型对照组则给与生理盐水，1 mL/200 g，1次/d。

1.7 观察指标及方法 药物干预前（造模成功1周）以及干预后第1、2、3周，各组随机选取5只大鼠，参照Siegal神经功能评分方法[8]进行评分。Siegal神经功能评分从0级至5级：0级正常；1级甩尾无力；2级后肢无力，行走时具有轻度困难；3级后肢无力，行走是具有明显不稳定性；4级站立不稳，但后肢能够移动；5级瘫痪，后肢无自主移动。评分越高，提示神经功能越差。对各时间点选择的大鼠采用脱颈法处死，逐层剥离皮肤及肌肉组织，找到L5神经根处自体移植包埋的尾椎椎间盘，正常对照组、假手术组则取L5神经根对应周围组织。经固定、脱水、包埋、切片、染色等步骤，采用免疫组化法检测该组织IL-1表达。

1.8 统计学方法 运用SPSS17.0统计学软件进行处理，计量资料采用单因素方差分析及t检验，以P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能评分 干预前，与模型对照组比较，补肝健腰方组、塞来昔布组神经功能评分无统计学差异（P＞0.05），且均高于假手术组。经灌胃治疗第1、2、3周，补肝健腰方组、塞来昔布组神经功能评分较模型对照组下降（P＜0.05），补肝健腰方组、塞来昔布组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。补肝健腰方组、塞来昔布组经灌胃治疗第1、2、3周神经功能评分均较干预前下降（P＜0.05）。提示干预前大鼠腰椎间盘突出模型神经功能评分升高，经补肝健腰方干预后，神经功能评分下降。见表1。

表1 各组大鼠神经功能评分结果比较

2.2 IL-1表达 模型对照组、补肝健腰方组、塞来昔布组干预前IL-1表达较正常对照组呈高表达，经药物干预后，补肝健腰方组、塞来昔布组IL-1表达减弱，见图1～4。干预前，与模型对照组比较，补肝健腰方组、塞来昔布组腰椎间盘突出局部组织IL-1表达无统计学差异（P＞0.05），且均高于假手术组。经灌胃治疗第1、2、3周，补肝健腰方组、塞来昔布组IL-1表达均较模型对照组下降（P＜0.05），补肝健腰方组、塞来昔布组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。补肝健腰方组、塞来昔布组经灌胃治疗第1、2、3周IL-1表达均较干预前下降（P＜0.05）。提示大鼠腰椎间盘突出局部IL-1表达增加，经补肝健腰方干预后，局部IL-1表达下降。见表2。

图2 各组干预第1周IL-1表达情况(×400)

图3 各组干预第2周IL-1表达情况(×400)

图4 各组干预第3周IL-1表达情况(×400)

表2 各组大鼠IL-1表达结果比较 (IOD值)

3 讨论

腰椎间盘突出症是临床上的常见病、多发病，是在腰椎间盘发生退变的病理基础上，再结合外力等其他因素，发生的纤维环膨出、破裂，髓核突出、脱垂等病理变化。本病可因突出的椎间盘刺激或压迫窦椎神经、脊神经根或马尾神经所引起的腰痛、神经根放射痛等症状的病变[9]。腰椎间盘突出症具有病程缠绵、易复发等特点，严重影响患者的生活。然而，关于本病的具体发病机制尚未完全阐明，目前认为与椎间盘机械压迫、化学炎症刺激及自身免疫密切相关。其中，化学炎症刺激系椎间盘压迫神经根引起不同程度的炎性反应，诱导如白介素、肿瘤坏死因子等炎性介质刺激神经根，从而产生疼痛等相关症状[10]。

近年来大量研究表明，炎症相关的信号通路与腰椎间盘突出症关系极为密切。研究发现，腰椎间盘突出的发病过程中，NF-κB信号通路得到激活，上调大量的炎性因子（如TNF-α、IL-1、IL-6）的表达，给与NF-KB抑制剂(PDTC)则可抑制信号通路，减少TNF-α、IL-1β等炎症因子表达水平，缓解疼痛反应[11-12]。IL-1常见的细胞因子，多由单核细胞、内皮细胞、成纤维细胞等细胞产生的，与炎症反应密切相关，参与机体的多种生理及病理反应。研究发现，IL-6在腰椎间盘突出症椎间盘及邻近组织异常聚集。提示其介导了炎症反应，诱导腰椎间盘细胞凋亡，加速退变，并导致神经根性疼痛的产生[13]。而对腰椎间盘突出症应用相关药物及治疗方法，可降低血清IL-1表达，达到治疗作用[14-15]。塞来昔布为非甾体类抗炎药，可抑制环氧化酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）来抑制前列腺素生成，可减少IL-1等细胞因子表达的作用[16-17]。

祖国医学中并没有“腰椎间盘突出症”病名，根据发病的特点，认为腰椎间盘突出症属于“腰腿痛”“痹症”“筋病”等范畴。根据腰椎间盘突出症的发病特点，仇湘中提出，本病的核心病机为“肝虚络痹”，治疗应“从肝论治”，处方以经验方补肝健腰方，取得比较满意的疗效[15]。该方来源于《医宗金鉴》《医学六要》中“补肝汤”，并结合腰椎间盘突出症的发病特点化裁而成。补肝健腰方组方原则补肝健腰、通络止痛，药物组成有炒枣仁、当归、白芍、熟地、杜仲、川芎、延胡索、蜈蚣、全蝎、甘草[18-20]。方中炒枣仁具有有养肝、宁心安神之效；当归补血养肝，和血调经；白芍养血柔肝和营；熟地甘温味厚，而质柔润，长于滋阴养血；杜仲甘温补益，共取补肝柔筋之功效。其中熟地、白芍为阴柔之品，配伍川芎、延胡索、蜈蚣、全蝎活血、理气、止痛，则补血而不滞血，和血而不伤血。且蜈蚣、全蝎辛温走窜，通经逐邪，有调达肝经、通络止痛之功，为镇痛、散结之要药，甘草调和诸药。

本研究结果发现，通过自体尾椎椎间盘移植制备的大鼠腰椎间盘突出症动物模型中，局部组织IL-1表达增加，神经根功能下降。经补肝健腰方灌胃干预，IL-1表达下降，神经功能得到改善与模型对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示补肝健腰方具有降低大鼠腰椎间盘突出症模型突出部位IL-1的表达，改善神经功能评分的作用。与之前的研究结果相符。补肝健腰方治疗腰椎间盘突出症是否从其他信号途径，有待下一步继续研究。