链脲佐菌素对糖尿病小鼠性腺功能的影响

2019-10-18杨文娟张嘉园马养民

陕西科技大学学报 2019年5期

杨文娟，张嘉园，马养民，龚频，王兰，陈瑶

(1.陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安 710021；2.陕西科技大学化学与化工学院教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室，陕西西安 710021)

0 引言

性腺功能减退症临床表现为性欲减退、勃起功能障碍 (erectile dysfunction，ED)等，且患者病情随着年龄的增长而加重[1,2].由于该病发病率高，患者大多讳疾忌医，加之传统观念束缚，易造成病情延误，严重影响生活质量，增加心理负担.目前涉及STZ对糖尿病小鼠的性腺功能影响的研究较少，因此，探究STZ对小鼠性腺功能的影响进而开展性腺功能减退症临床前研究的工作尤为必要[3].

Abidu Figueiredo M等[4]采用四氧嘧啶对新西兰白兔进行耳缘静脉注射从而诱导ED动物模型，但缺点是四氧嘧啶对机体组织毒性较高，且用量差异较大[5].Mulhall J P等[6]通过手术或药物去势的方法，对大鼠输精管和相关血管进行结扎和切除，建立雄激素分泌减少或作用障碍的ED模型，但手术难度较高.Huang Y C等[7]采用高脂饲料对大鼠饮食进行干预，5个月后血脂升高，且表现出明显的性腺功能损伤，但造模时间周期较长.

造成性腺功能减退症的危险因素包括糖尿病、高血压、肥胖、抑郁及其他因素[8,9]，其中糖尿病患者性腺器官损伤及功能减退尤为严峻[10].流行病学表明，全世界35%～70%的糖尿病男性患者受到性欲减退、勃起功能障碍的影响，其发病率是非糖尿病男性的3倍，年龄超过45岁，病程超过10年，表现的更为显著[11].糖尿病患者勃起功能障碍患病率为52.5%,其中37.5%的男性患者由Ⅰ型糖尿病引起，66.3%的男性患者由Ⅱ型糖尿病引起[12].

目前糖尿病造模方法包括链脲佐菌素或四氧嘧啶注射，以及联合高脂高糖饮食干预等方法，链脲佐菌素(STZ)诱导是最经典的糖尿病建模方法[13]，通过进一步减少或终止动物胰岛素分泌，导致血糖升高，体内代谢发生紊乱，但大剂量注射易造成动物死亡率上升.在糖尿病动物勃起功能障碍筛选过程中，阿扑吗啡需要较长的观测时间，且只能以大鼠阴茎勃起情况进行定性研究[14]；而对阴茎海绵体内压进行测定可对勃起功能进行定量评价，具有一定稳定性[15]，但预先要对动物进行麻醉处理，易造成实验动物死亡，进而影响后续研究.小鼠是最常用实验动物之一，其阴茎内部生理结构及勃起时海绵体内生理变化都与人类具有较高的相似度，且体型小、易捕捉、性成熟较快[16].因此，本研究旨在以小鼠为实验动物，采用小剂量多次腹腔注射STZ，通过STZ诱导小鼠血糖升高进而影响性腺功能的研究.以期为糖尿病并发性腺功能减退的发病机理、治疗靶点及药物研究奠定基础.

1 材料与方法

1.1 实验动物

昆明雄性小鼠70只，雌性小鼠70只，购于西安交通大学医学部实验动物中心，生产许可证号SCXK(陕)2017-003，体质量25±2 g.室温18 ℃～22 ℃，空气流通，定期更换垫料，雌雄分笼，自由摄食饮水，保持昼夜节律周期.

1.2 实验药品及试剂

链脲佐菌素(美国Sigma公司，溶解于0.1 mol/L(pH4.4)柠檬酸盐缓冲液，临用前配制)；雌二醇注射液(四川金科药业有限责任公司)；ACCU-CHEK活力型血糖试纸(罗氏诊断试剂公司)；睾酮测定试剂盒(南京翼飞雪生物科技有限公司)，其余试剂均为分析纯.

1.3 实验仪器

全活力血糖仪(德国罗氏公司)；Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪(芬兰THERMO)；BSASS2S电子天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司)；PHS-3C精密PH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；WH3微型涡旋混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)；DM2500/DFC正置式显微镜(德国Leica)；HA/KD-202A电脑快速冷冻石蜡两用切片机(北京恒奥德仪有限公司).

1.4 实验方法

1.4.1 STZ腹腔注射

昆明雄性小鼠70只，适应性饲养7 d，通过与性成熟雌性小鼠进行交配，交配实验证明小鼠具有正常性功能.随机分为对照组(Control，10只)和模型组(Model，60只)，模型组小鼠禁食12 h后，腹腔注射1%STZ溶液，剂量为75 mg/kg，连续注射2 d，1次/d，72 h后测小鼠空腹血糖值，再分别于7 d、14 d、21 d、28 d测定小鼠空腹血糖值.

1.4.2 交配实验

分别于7 d、14 d、21 d、28 d对小鼠进行交配实验.交配前2 d，雌性小鼠每日皮下注射雌二醇注射液(1 mg/kg)刺激雌鼠发情.交配于19:00～23:00进行，观察时保持室内安静，减少灯光照明，调至昏暗，足以观察交配行为即可，并采集交配行为录像.具体操作为：取雄性小鼠1只置于30 cm× 50 cm× 20 cm的观察盒内，适应5 min后，放入发情雌性小鼠1只，记录20 min内骑跨次数(mount frequency，MF)：观察时间内爬高总次数，有无插入均计数;交配次数(intromission frequency，IF)：雄鼠射精前插入的总次数.统计小鼠交配行为的相关数据[17].

1.4.3 血清指标测定

造模28 d天后，小鼠脱颈椎处死，眼球取血，3 000 r/min离心10 min，分离血清.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定血清睾酮水平.在450 nm处测定吸光度，绘制标准曲线计算小鼠血清睾酮浓度.

1.4.4 睾丸组织形态观察

打开小鼠腹腔，迅速取出睾丸，切成1 cm3组织块，放入10%甲醛溶液中固定24 h，流水冲洗24 h，依次经过乙醇脱水，二甲苯透明，液体石蜡包埋，切片、脱蜡、复水，苏木精染色，1%盐酸酒精分化，氨水返蓝，曙红染色，中性树胶封片，于镜下观察睾丸组织形态.

1.4.5 统计学分析

用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，用以计算模型组、对照组均数并进行单因素分析.比较独立组分选用t-test，以P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果与讨论

2.1 小鼠空腹血糖测定结果

72 h血糖测定结果为：模型组60只小鼠中血糖值高于11.1 mmol/L的小鼠为53只，糖尿病成模率为88.33%.再分别于7 d、14 d、21 d、28 d检测小鼠空腹血糖的变化.由图1可知，对照组小鼠血糖值均处于正常范围内.与对照组相比，模型组小鼠的血糖值显著增高(P<0.05)，差异具有统计学意义，表明STZ造成小鼠胰腺损伤，血糖持续升高.

图1 小鼠血糖变化趋势图

2.2 小鼠交配实验结果

分别于7 d、14 d、21 d、28 d，对对照组和模型组小鼠进行交配实验，结果如图2、图3所示.与对照组比较，STZ损伤后14 d，模型组小鼠跨骑次数(MF)、交配次数(IF)明显减少，其差异具有统计学意义(P<0.01).且该损伤不能自愈，21 d、28 d仍然表现出持续性的性腺功能减退，结果表明STZ诱导的糖尿病小鼠出现典型的性腺功能减退.

图2 小鼠交配次数变化

图3 小鼠跨骑次数变化

2.3 血清睾酮水平测定结果

对照组、模型组小鼠的血清睾酮测定结果如图4所示.由结果可知，模型组血清睾酮水平明显降低，与对照组相比具有显著性差异(P<0.05).表明STZ诱导的糖尿病可以引起小鼠血清睾酮水平降低，进而使性腺功能减退，与交配实验结果相符.

图4 小鼠血清睾酮水平测定结果

2.4 睾丸组织病理形态改变

小鼠睾丸组织切片H.E染色观察，结果如图5所示.对照组睾丸的曲精小管中细胞排列较紧密，精原细胞、初级精母细胞紧贴基膜内缘，精子细胞可见，形态规则；模型组睾丸组织生精细胞与基底膜脱离，生精上皮细胞排列紊乱，精子细胞数量减少.

a:精原细胞;b:初期精母细胞;c:精子细胞(a)Control组

d:生精细胞与基底膜脱离;e:生精上皮细胞排列紊乱;f:精子细胞数量减少(b)Model组图5 小鼠睾丸组织形态图(10×4)

性腺功能减退症是糖尿病的常见并发症之一，其主要表现为勃起功能障碍.有研究表明，糖尿病勃起功能障碍的发病机制主要包括糖尿病性血管神经病变、内分泌改变及社会心理等各方面因素，虽然在病理生理学研究领域已取得一定的研究进展，但由于其发病机制错综复杂，影响因素众多，至今无法完全阐明[18].临床上相应的治疗手段还处于不完善阶段，治疗效果仍然不尽人意，有必要对其发病机理，影响因素进行更加深入的研究.因此通过研究STZ对糖尿病小鼠性腺功能的影响，构建有效、稳定的ED动物模型就显得尤为重要，本研究旨在探索STZ对糖尿病性腺功能减退小鼠的诱导作用，总结STZ作为诱导剂的适宜剂量，具有安全稳定的特点.

链脲佐菌素(STZ)是一种氨基葡萄糖-亚硝基脲，是一种强烷基化药剂.可诱导DNA双键断裂，抑制葡萄糖转运，影响葡萄糖激酶功能，通过质膜中的 GLUT2 葡萄糖转运蛋白(GLUT2 glucose trasport protein)有选择性地进入胰岛β细胞中，产生特异性细胞毒性，损伤胰岛β细胞[19]，导致胰岛素分泌减少，血糖升高，进而引发机体代谢紊乱而改变性腺内环境，干扰性腺代谢，使其机能发生变化.本研究通过对模型组小鼠进行STZ小剂量多次腹腔注射，诱导建立糖尿病性腺功能减退动物模型，并通过交配实验、血清睾酮水平、组织形态观察等对模型进行验证，其中模型组跨骑次数、交配次数明显减少(P<0.01)；血清睾酮水平显著降低(P<0.05)；对睾丸进行组织形态观察发现，与对照组相比，模型组精子细胞数量减少、生精上皮细胞排序紊乱.研究表明，STZ注射产生的毒性与小鼠年龄具有一定相关性.在造模过程中为了降低死亡率，应筛选12周或更小的小鼠进行STZ注射，如使用老年小鼠则需要相应减少STZ的剂量，以保证小鼠存活率[20].