蓝果忍冬不同发育时期叶片类黄酮化合物及抗氧化活性分析

谢佳璇，张 妍，秦 栋，刘 佩，刘化禹，霍俊伟

(东北农业大学 园艺园林学院，寒地小浆果开发利用国家地方联合工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150030)

蓝果忍冬(LoniceracaeruleaL.)属忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lonicera)多年生灌木，别称蓝靛果、黑瞎子果、羊奶子、山茄子等，主要分布于北半球的寒带地区，是近年来新兴的一种小浆果作物[1]，古时在中国、日本、俄罗斯等部分国家就已被用作药物[2]。蓝果忍冬果实中富含高含量的花青素和丰富的多酚、维生素C等生物活性物质[3]，逐渐引起人们的重视。果实采摘之后，残留的叶片作为果实采摘后的副产品，往往为人们所忽视。现有研究表明，蓝果忍冬叶片中含有丰富的类黄酮物质且具有一定的抗氧化活性[4]，具有一定的开发利用价值。

类黄酮化合物作为酚类物质中的一种，种类繁多且在植物中分布广泛，在植物体内发挥着抗病菌、抗氧化、驱虫、视觉吸引等功效[5]，同时还与人类的膳食、医药、制造业等密不可分[6]。国内外的研究结果表明，类黄酮化合物在人体内可表现出明显的生理活性，如可以清除自由基、抗菌[7-8]、抗溃疡、消炎、抗高脂血症、降血压[9]及增强抗氧化能力、抗癌、抗病毒[10]等，还具有改善肥胖症和认知衰退[11]等功效。

近年来，对蓝果忍冬的研究主要集中在果实上，对其叶片的研究相对较少。Bonarska-Kujawa等[12]对蓝果忍冬果实及叶片中的类黄酮成分进行鉴定，确定蓝果忍冬品种‘Green’的叶片中含有5种类黄酮化合物，其中槲皮素为蓝果忍冬叶片中的主要类黄酮化合物。Oszmiaå等[13]等对蓝果忍冬叶片中的酚类物质进行检测，共发现6种羟基肉桂酸酯、4种槲皮素衍生物和2种山奈酚衍生物。本试验选取蓝果忍冬主栽品种‘L4’、‘Berel’为研究对象，选取果实采摘后不同时期的生理成熟叶，对其类黄酮物质种类和含量进行分析及鉴定，并探究了其抗氧化活性，以期为果实采摘之后蓝果忍冬叶片的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为蓝果忍冬品种‘L4’(勘察加忍冬，LonicerakamtschaticaSevast)、‘Berel’(又名‘蓓蕾’,L.altaicaPall×L.kamtschaticaSevast×L.kamtschaticaSevast)，树龄为5年，采自东北农业大学小浆果资源圃(哈尔滨)，所有植株按照常规方法种植，统一田间管理。蓝果忍冬果实的成熟期一般为6月上旬至中旬，因此从2016年6月9日开始采集叶片，每隔14 d采集1次，至2016年8月6日结束，共采集5次。选择长势良好、整齐的植株各5株，随机采取阳面外围生长健壮的结果枝中部叶片，混匀，用冷冻干燥机烘干后研磨成粉，保存于棕色干燥器中用于后续分析。

1.2 试 剂

色谱纯级甲醇、乙腈，美国Fisherg公司；分析纯级纯甲酸，中国安谱；分析纯级三氯乙酸(TFA)，中国百灵威；分析纯级无水甲醇，北京化工厂；分析纯级没食子酸(GA)、槲皮素3-O-芦丁糖苷(Rutin，标准品)，中国药品生物制品检定所。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)、三吡啶基三嗪(TPTZ)，美国Sigma公司；分析纯级氯化亚铁、冰醋酸、盐酸、醋酸钠，中国科创欣达公司。色谱柱(ODS-80Ts QA C18反相硅胶柱)，日本Tosoh株式会社；保护柱(C18反相保护柱)，中国安谱公司。

1.3 类黄酮的提取

类黄酮提取方法参考文献[14]并加以改动。称取0.2 g叶片粉末于2 mL离心管中，加入1 mL甲醇，混匀，之后置于超声清洗器中，20 ℃超声辅助抽提20 min，离心，取上清液。残渣用同样的方法重复提取3次，混合所有上清液。取700 μL上清液于1.5 mL离心管中，加入300 μL ddH2O，-40 ℃静置48 h，以去除提取液中的叶绿素及其他脂溶性杂质，然后离心5 min取上清液，再用微孔滤膜(0.22 μm)过滤， 4 ℃保存。同时测定样品质量浓度(g/mL)，用于后续计算分析。

1.4 定性与定量分析

采用高效液相色谱(HPLC-DAD)与质谱(LC-ESI-MS2)联用法对类黄酮成分进行定性分析，参考文献[15]方法并略加改动。HPLC测定条件如下：流动相A相为体积分数0.1% TFA水溶液，B相为纯乙腈；洗脱梯度为0 min 13% B，15 min 26% B，25 min 28% B，30 min,13% B。每次进样10 μL，流速0.8 mL/min，柱温控制在35 ℃。类黄酮检测波长为350 nm。质谱分析条件为：电喷雾离子化(ESI)，负离子模式，全离子扫描，扫描范围(质子数与电荷数的比值)即质荷比(m/z)为50～1 000，毛细管电压1 500 V，干燥气(N2)流速500 L/h，干燥温度350 ℃，毛细管出口电压为30 V，锥孔气流速50 L/h，碰撞气体流速0.15 mL/min。

参考文献[16-17]的方法测定叶片中的类黄酮成分含量。以质量浓度0.005～0.5 mg/mL的Rutin作为标准品，通过HPLC在350 nm处绘制标准曲线(HPLC测定条件同上)，计算每克干叶片中含有的Rutin含量(mg/g)。

1.5 抗氧化活性测定

1.5.1 DPPH·自由基清除能力 ‘L4’和‘Berel’叶片提取物对DPPH·清除能力的测定参考Brand-williams等[18]的方法进行，以0.2～1 mmol/L没食子酸(GA)作为标准品。

1.5.2 铁离子还原能力(FRAP) ‘L4’和‘Berel’叶片提取物FRAP的测定参考Benzie等[19]的方法进行，以0.1～1 mmol/L GA作为标准品。

1.6 数据分析

以上试验均重复3次，利用MassLynx V 4.1软件对质谱的鉴定结果进行分析，用Excel 2007软件和Origin 7.0绘图，用SPSS 18.0软件进行ANOVA分析及Person相关性分析。

2 结果与分析

2.1 蓝果忍冬叶片类黄酮化合物的定性分析

以06-09采摘的叶片为材料，利用HPLC-DAD和HPLC-ESI-MS2对蓝果忍冬品种‘L4’、‘Berel’叶片中的类黄酮成分进行鉴定，结果见图1。

图1 蓝果忍冬叶片(采摘日期为06-09)类黄酮HPLC图谱

由图1可知，‘L4’和‘Berel’叶片中分别含有11和10种类黄酮化合物，与‘L4’叶片相比，‘Berel’叶片缺失‘L4’叶片中的4号峰，其他峰的位置与‘L4’叶片相同，但峰面积存在一定差异。因此，以‘L4’叶片为例对其叶片中的类黄酮化合物成分进行分析，判断依据为HPLC分析的保留时间、紫外-可见吸收光谱数据和质谱数据(表1)，参照文献[20-23]的方法进行分析。

由表1可知，5，7和9号峰具有槲皮素苷元的特征质荷比m/z300([Y0-H]-)。阿布拉江·克依木[24]的研究表明，当类黄酮的自由基苷元离子([Y0-H]-)的相对丰度高于苷元离子([Y0]-)时，发生3位糖基化。5，7，9号峰m/z300的相对丰度均高于m/z301，因此为3位糖基化。5号峰MS碎片为m/z595，MS2碎片为m/z301，两者之间丢失294 u，因此推测其为槲皮素3-O-桑布糖苷。7，9号峰的推测方式相同，二者分别是槲皮素3-O-芸香糖苷和槲皮素3-O-鼠李糖苷。

表1 蓝果忍冬‘L4’叶片类黄酮成分的鉴定

注：括号中的数值表示离子的强度，即相对丰度。

Note:The values in parentheses indicate the strength of ions, also known as relative abundance.

表1显示，3，4，6，10号峰均含有山奈酚苷元的特征质荷比m/z285([Y0]-)，通过丢失分子量推测4号峰为山奈酚3-O-桑布糖苷、6号峰为山奈酚3-O-芸香糖苷、10号峰为山奈酚3-O-新橙皮糖苷。3号峰的m/z285([Y0]-)高于m/z284([Y0-H]-)，发生7位糖基化，推定其为山奈酚7-O-芸香糖苷。

表1显示，1号峰具有异鼠李素苷元的特征碎片离子m/z314([Y0-H]-)和m/z315([Y0]-)，m/z315的相对丰度高于m/z314，表明发生了7位糖基化，同时丢失了308 u，推测其为异鼠李素7-O-芸香糖苷。2，8号峰均含有香叶木素苷元的特征质荷比m/z298([Y0-H]-)，因此推测2号峰为香叶木素3-O-葡萄糖，8号峰为香叶木素3-O-芸香糖苷。11号峰有芹菜素苷元离子特征碎片离子m/z269([Y0-H]-)，推测其为芹菜素7-O-芸香糖苷。

2.2 蓝果忍冬叶片类黄酮化合物的定量分析

2.2.1 不同发育时期‘L4’叶片类黄酮种类与含量的差异 蓝果忍冬‘L4’叶片中类黄酮化合物的定量分析结果见表2。表2显示，06-09和06-23采摘叶片中的类黄酮种类最多，共有11种类黄酮化合物，分别是槲皮素3-O-桑布糖苷、槲皮素3-O-鼠李糖苷、槲皮素3-O-芸香糖苷、山奈酚7-O-芸香糖苷、山奈酚3-O-新橙皮苷、山奈酚3-O-桑布糖苷、山奈酚3-O-芸香糖苷、香叶木素3-O-芸香糖苷、香叶木素3-O-葡萄糖苷、芹菜素7-O-芸香糖苷和异鼠李素3-O-芸香糖苷；之后随着采摘时间的延长，叶片中的类黄酮种类逐渐减少，08-06采摘叶片中的类黄酮种类最少，仅有7种物质，与之前相比缺少山奈酚3-O-新橙皮苷、山奈酚3-O-桑布糖苷、山奈酚3-O-芸香糖苷和芹菜素7-O-芸香糖苷。

表2 不同发育时期‘L4’叶片中的类黄酮化合物及其含量

注：表中数据为“平均值±标准差”。同列数据后标不同小写字母表示不同时期之间差异显著(P<0.05)。下表同。

Note:Data in the table are ‘mean±standard error’.Different lowercase letters indicate significant difference among dates (P<0.05). The same below.

由表2可知，06-09-06-23，除山奈酚3-O-芸香糖苷和香叶木素3-O-葡萄糖苷外，‘L4’叶片中其余各类黄酮组分的含量及总类黄酮含量(TFC)均随着采摘时间的推移而逐渐上升，在06-23达到峰值，之后随着时间的推移逐渐降低或消失；07-22采摘叶片中的类黄酮组分的含量及TFC总体有小幅回升，且略高于07-08；07-22-08-06，叶片中各类黄酮组分含量及TFC呈显著降低趋势。不同时期叶片中的TFC及各类黄酮组分含量总体表现为06-23>06-09>07-22>07-08>08-06。

2.2.2 不同发育时期‘Berel’叶片类黄酮种类与含量的差异 蓝果忍冬‘Berel’叶片中类黄酮化合物的定量分析结果见表3。

表3 不同发育时期‘Berel’叶片中的类黄酮化合物及其含量 Table 3 Contents of flavonoids glycosides in ‘Berel’ leaves at different growth stages mg/g

由表3可知，06-09，06-23，07-08采摘叶片中的类黄酮种类表现一致，均含有10种类黄酮化合物，与‘L4’相比缺少山奈酚3-O-芸香糖苷，之后随着采摘时间的延长叶片中的类黄酮种类逐渐减少，08-06采摘叶片中的类黄酮种类最少，仅有7种物质，未再检测到槲皮素3-O-桑布糖苷、山奈酚3-O-桑布糖苷、山奈酚3-O-芸香糖苷和异鼠李素3-O-芸香糖苷。

由表3可知，06-09-06-23，‘Berel’叶片中的各类黄酮组分含量及TFC均随着采摘时间的推移逐渐上升，在06-23达到峰值；之后随着时间的推移逐渐降低，各类黄酮组分含量及TFC总体呈降低趋势。不同时期采摘‘Berel’叶片中的TFC及类各黄酮组分含量由高到低总体表现为06-23>06-09>07-08>07-22>08-06。‘L4’和‘Berel’叶片中的类黄酮化合物又可划分为5大类，其含量见表4。由表4可知，槲皮素苷是‘L4’叶片中的主要类黄酮化合物，占总类黄酮含量的56%以上，以06-23含量最高，可达21.17 mg/g。同时，槲皮素苷也是‘Berel’叶片中的主要类黄酮化合物，占总类黄酮含量的57% 以上，也以06-23含量最高，可达11.83 mg/g。

表4 不同时期蓝果忍冬‘L4’和‘Berel’叶片5类类黄酮含量的比较

2.2.3 不同品种叶片类黄酮种类与含量的差异 表2和表3显示，不同品种蓝果忍冬叶片的类黄酮种类存在一定差异。06-09和06-23采摘的‘L4’叶片中的类黄酮种类共有11种，‘Berel’叶片中有10种，与前者相比，后者无山奈酚3-O-芸香糖苷。07-08采摘的‘Berel’叶片的类黄酮种类较‘L4’多1种，07-22，08-06采摘的两品种叶片中的类黄酮化合物的数量一致，但两者的种类存在差异。由表2～3还可知，不同品种蓝果忍冬叶片的类黄酮含量也存在一定差异。在各采样时期，‘L4’叶片中的TFC均高于‘Berel’，在06-23，两品种的TFC均达到峰值，分别为37.21和20.61 mg/g。由表4可知，在各采样时期，‘L4’叶片中的槲皮素苷、山奈酚苷、异鼠李素含量均较‘Berel’高出2～7倍，但香叶木素及芹菜素的含量却低于‘Berel’。

2.3 蓝果忍冬叶片抗氧化活性分析

2.3.1 DPPH·自由基的清除能力 表5显示，不同时期 ‘L4’和‘Berel’ 叶片提取物对DPPH·自由基的清除能力并不相同。06-23采摘的‘L4’和‘Berel’叶片提取物对DPPH·自由基的清除能力最高，分别为51.90，25.07 mg/g。各时期采摘的‘L4’叶片提取物对DPPH·自由基的清除能力表现为06-23>06-09>07-22>07-08>08-06，且差异显著。各时期采摘的‘Berel’叶片提取物对DPPH·自由基的清除能力表现为06-23>06-09>07-08>07-22>08-06，也存在显著差异。另外，‘L4’叶片提取物对DPPH·自由基的清除能力在各个时期均优于‘Berel’。

表5 不同发育时期蓝果忍冬叶片的抗氧化活性 Table 5 Antioxidant activities of Lonicera caerulea L. leaves at different developmental stages mg/g

2.3.2 铁离子的还原能力 表5显示，不同时期采摘的‘L4’和‘Berel’叶片提取物对铁离子的还原能力(FRAP)表现也不同。06-23采摘的‘L4’和‘Berel’叶片提取物的FRAP最高，分别为125.66，91.73 mg/g。各时期采摘的‘L4’叶片提取物的FRAP表现为06-23>06-09>07-22>08-06>07-08，‘Berel’叶片提取物中的FRAP表现为06-23>06-09>07-08>07-22>08-06，且‘L4’叶片提取物的FRAP在各个时期均优于‘Berel’叶片。

2.3.3 总类黄酮含量(TFC)与抗氧化活性的相关性 表6显示，‘L4’和‘Berel’叶片提取物中的总类黄酮含量与抗氧化活性之间存在一定相关性。2个品种蓝果忍冬叶片中的总类黄酮含量与其DPPH·自由基清除力和铁离子还原能力(FRAP)均呈极显著正相关(P<0.01)。

表6 蓝果忍冬叶片总类黄酮含量与抗氧化活性的相关性

注： **表示存在极显著相关关系 (P<0.01)。

Note: ** indicates extremely significant correlation(P<0.01).

3 讨论与结论

蓝果忍冬叶片作为果实采收后的副产品，往往容易被人们所忽视。前人研究表明，蓝果忍冬叶片中含有丰富的类黄酮，具有一定的开发利用价值[25]。随着蓝果忍冬的生长发育，不同发育时期叶片内的物质代谢活动存在差异，次生代谢产物的含量与种类亦有所不同。本研究以生产中的蓝果忍冬主栽品种‘L4’、‘Berel’叶片为试材，探究不同品种叶片在不同时期的类黄酮含量与种类的差异。结果表明，不同品种叶片不同发育时期的类黄酮种类存在一定差异。本研究从‘L4’叶片中检测出11种类黄酮化合物，从‘Berel’叶片中检测出10种类黄酮化合物，与‘L4’相比‘Berel’中无山奈酚3-O-芸香糖苷。随着采摘时间的延长，叶片中的类黄酮种类逐渐减少。 Bonarska-Kujawa等[12]等从蓝果忍冬叶片中分析鉴定出5种黄酮类化合物[12]，Oszmiaå等[13]从蓝果忍冬叶片中鉴定出12种酚类物质[13]，可知本试验进一步丰富了蓝果忍冬叶片中类黄酮化合物分离鉴定方面的研究。

本研究发现，蓝果忍冬品种‘L4’、‘Berel’叶片在不同发育时期的类黄酮含量存在一定差异，生理成熟叶中的类黄酮种类及含量明显多于老叶，这与前人在桑叶中的研究结果[26-27]相一致。06-09-06-23采摘的‘L4’、‘Berel’叶片中的TFC随着发育时间的推移逐渐上升，均在06-23达到峰值，之后随着时间的推移总体呈降低趋势。在本研究中，07-08-08-06采摘的‘L4’叶片中的TFC在07-22有小幅回升，这可能与植物的次生代谢过程受环境、非生物和生物因素等的影响有关[28]。有研究发现，黑穗醋栗叶片中的TFC可达(2.05±0.34) mg/g，并具有一定的生理活性[29-30]。本试验结果说明，蓝果忍冬的生理成熟叶中含有丰富的类黄酮化合物，‘L4’生理成熟叶中的TFC最高可达37.21 mg/g，故其叶片可作为一种天然类黄酮化合物的提取原料。同时，叶片作为植物代谢库，为果实的生长发育提供能量[31]，在果实成熟期采摘叶片势必会损伤树体，降低果实品质。蓝果忍冬果实的成熟期为6月上旬至中旬[32]，叶片中的类黄酮含量在06-23达到峰值，此时采摘即可有效避免与果实成熟期相重叠，减轻摘叶对果实品质造成的影响，可在不影响果实品质的前提下，使叶片得到有效的开发与利用。

本研究中，不同蓝果忍冬品种叶片类黄酮种类及含量存在一定差异，在含量高峰期(06-09-06-23)‘L4’叶片中的类黄酮种类多于‘Berel’，而含量低峰期(07-08-08-06)则与‘Berel’相同。除此之外，‘L4’叶片各个时期中的TFC均高于‘Berel’，其中‘L4’叶片的槲皮素苷、山奈酚苷、异鼠李苷含量较‘Berel’高2～7倍，但香叶木素及芹菜素含量却低于‘Berel’。前人研究表明，不同基因型的蓝果忍冬果实中，其酚类物质的含量存在差异[33]。因此推测，‘L4’与‘Berel’叶片中类黄酮种类与含量存在的差异可能与基因型的影响有关。从叶片开发利用角度来看，‘L4’叶片较‘Berel’更适宜用来开发与利用。同时，槲皮素苷为蓝果忍冬叶片主要的类黄酮成分，其含量占总类黄酮含量的50%以上，这与前人的结论[12-13]相一致。

本试验对2种蓝果忍冬叶片的抗氧化性进行了分析，结果表明，同一品种不同时期的叶片提取物对DPPH·自由基的清除能力有所差异。06-23采摘的‘L4’、‘Berel’叶片对DPPH·自由基的清除能力最强，分别可达51.90和25.07 mg/g，而此时2个品种叶片中的TFC也最高。相关性分析表明，蓝果忍冬叶片提取物对DPPH·自由基的清除能力与TFC呈极显著正相关，与前人对嘉宝果的研究结果[34]相一致。06-23采摘的‘L4’、‘Berel’叶片的FRAP也最高，分别可达125.66和91.73 mg/g，且叶片提取物的FRAP与TFC也呈极显著正相关。不同时期叶片的抗氧化活性不同，随着采摘时间的延长，叶片抗氧化活性总体呈降低趋势。前人发现罗勒叶片对DPPH·自由基的清除力可达250 μg/mL[35]，柿子叶片对DPPH·自由基的清除力可达41.52 mg/g[36-37]，故罗勒叶片和柿子叶片常用于制药，结合本试验结果分析发现，蓝果忍冬叶片具有一定的抗氧化活性，故可将其作为天然类黄酮的提取来源进行开发和利用。

综上所述，蓝果忍冬叶片不同发育时期的类黄酮种类与含量及抗氧化活性存在一定差异。06-23采摘叶片中的类黄酮种类、含量及抗氧化活性明显高于其他时期，是两品种叶片的最佳采摘时期。‘L4’叶片的类黄酮种类与含量及抗氧化活性均优于‘Berel’，因此06-23采摘的‘L4’叶片可作为天然类黄酮提取的优质来源之一。本研究比较了不同蓝果忍冬品种叶片类黄酮的种类和含量，筛选了类黄酮含量高的种质资源及叶片最佳采摘日期，为进一步进行蓝果忍冬资源的评价与利用、品种改良和新品种选育提供了指导。但本研究仅探讨了TFC与抗氧化活性之间的相关性，而对于具体那种类黄酮单体物质在其中起主要作用，还有待进一步研究。