基于指纹图谱结合化学计量学的香砂平胃颗粒质量评价

元晓静

（中国人民解放军联勤保障部队第九○○医院，福建 福州 350000）

香砂平胃颗粒是由炒苍术、姜炙厚朴、陈皮、醋香附、甘草、砂仁制成的中药复方制剂，具有健脾、温中、燥湿功效，用于治疗饮食不节、食湿互滞、胃脘胀痛、消化不良［1］。《中华人民共和国卫生部药品标准 中药成方制剂》WS3- B2369 - 97 中仅有颗粒剂检查项，相关文献仅采用高效液相色谱（HPLC）法对方中姜炙厚朴、陈皮的3个成分做了定量检测。指纹图谱结合化学计量学已广泛用于评价中药及其制剂的质量，其中指纹图谱通过HPLC 法得到中药或中药制剂的特征成分色谱图，借助相似度评价系统，实现对中药及其制剂内在质量的一致性评价和产品稳定性的全面监测［2-4］。聚类分析（CA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）等化学计量学方法可对分散的数据进行分析［5-7］，发挥其高预测精度优势，筛选出质量差异标志物，二者结合既能体现整体信息，又能说明个体差异。本研究中通过建立HPLC 指纹图谱结合化学计量学分析出不同批次香砂平胃颗粒的相似性和稳定性，筛选出差异性成分，为香砂平胃颗粒标准的全面提升提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司），配有可变换波长紫外检测器；BT55S 型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司，精度为0.01 mg）；KQ -550D型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为500 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

对照品苍术素（批号为111924 - 202006，含量99.3%），厚朴酚（批号为 110729 - 202015，含量99.4%），和厚朴酚（批号为 110730 - 202111，含量99.1%），橙皮苷（批号为 110721 - 202116，含量95.3%），川陈皮素（批号为 112055 - 202102，含量99.6%），甘草苷（批号为 111610 - 202113，含量97.8%），均购自中国食品药品检定研究院；苍术醇（成都曼思特生物其余科技有限公司，批号为200759-21-4，纯度为99.1%）；其余试剂均为色谱纯，水为屈臣氏蒸馏水；香砂平胃颗粒［云南腾药制药股份有限公司，规格为每袋10 g，共14 批，编号为S1 - S5（生产于2021年），S6-S10（生产于2020 年），S11-S14（生产于2019年）］。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters XTERRA C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相［8-10］：乙腈（A）- 0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～20 min 时 20%A → 45%A，20～32 min 时45%A → 60%A，32～43 min 时 60%A，43～60 min 时60%A → 85%A）；波长：220 nm（20～32 min 时苍术素、苍术醇），284 nm（0～20 min时甘草苷、橙皮苷，32～60 min，厚朴酚、和厚朴酚、川陈皮素）；流速：1.0 mL/ min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

取苍术素、苍术醇、厚朴酚、和厚朴酚、橙皮苷、川陈皮素、甘草苷对照品各适量，精密称定，加甲醇溶解，得质量浓度分别为0.113 2，0.100 5，0.100 2，0.098 6，0.057 4，0.050 1，0.030 8 mg/mL的混合对照品溶液。

取样品5 袋，研匀，取2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，称定质量，超声处理（功率为450 W）40 min，称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

按处方组成和生产工艺分别制备缺炒苍术、姜炙厚朴、陈皮和甘草的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

精密度试验：取样品（编号为S2）适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次。结果以12号峰苍术素为参照，其余22个共有峰相对保留时间的RSD为0.39%～0.57%（n=6），相对峰面积的RSD为1.18%～1.74%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2项下供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别于0，3，6，9，12，15，20 h时进样测定。结果显示，以12号峰苍术素为参照，其余22个共有峰相对保留时间的RSD为0.46%～0.72%（n= 7），相对峰面积的RSD为1.33%～1.85%（n=7），表明供试品溶液在20 h内稳定。

重复性试验：取样品（编号为S2）各适量，共6份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定。结果以12 号峰苍术素为参照，其余22 个共有峰相对保留时间的RSD为0.13%～0.26%（n=6），相对峰面积的RSD为1.05%～1.42%（n=6），表明方法重复性良好。

2.4 指纹图谱［11-12］

指纹图谱建立及相似度评价：取14批样品（编号为S1 - S14），按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样分析。根据中药指纹图谱相似度评价系统2012A 版，以编号为S2 样品的色谱图为参考，建立香砂平胃颗粒指纹图谱的共有模式，确定共有峰23个，详见图1。其中，12号峰（苍术素）保留时间适中，色谱峰响应最大，故选择为参照峰（R）。与对照图谱比较，各指纹图谱的相似度在0.971～0.994 之间，表明样品各批次间共有成分基本一致。相似度评价结果见表1。

表1 14批香砂平胃颗粒相似度评价结果Tab.1 Results of similarity evaluation of 14 batches of Xiangsha Pingwei Granules

图1 14批香砂平胃颗粒高效液相色谱叠加指纹图谱Fig.1 HPLC superimposed fingerprint of 14 batches of Xiangsha Pingwei Granules

共有峰指认及归属：取2.2项下混合对照品溶液和阴性对照品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图，并与图1 进行对比指认，结果见图2 和图3。共有峰中，3，4，9，12，17，20，21 号色谱峰分别指认为甘草苷、橙皮苷、苍术醇、苍术素、川陈皮素、和厚朴酚、厚朴酚；其中，3 号峰归属于甘草，4 号峰和17 号峰归属于陈皮，9号峰和12号峰归属于炒苍术，20号峰和21号峰归属于姜炙厚朴。

图2 混合对照品溶液高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of mixed reference solution

图3 阴性对照品溶液高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of negative reference solution

2.5 CA

采用SPSS 24.0统计学软件分析，以14批样品中23个共有峰的峰面积为变量，采用组间连接CA［13］。由图4可知，14 批样品按生产年份可聚为三类，分别为S1-S5，S6-S10，S11-S14。

图4 14批香砂平胃颗粒聚类分析图Fig.4 Cluster analysis of 14 batches of Xiangsha Pingwei Granules

2.6 OPLS-DA

以14 批样品中23 个共有峰的峰面积为变量，采用SIMCA 14.1 软件进行 OPLS-DA［5，14］，得出造成 3 组间差异的标志性共有峰，详见图5。结合变量重要性投影值（VIP）筛选出导致14 批样品差异的主要共有峰。以VIP>1 为标准，筛选出5 个差异性标志物的色谱峰，分别为7号峰、9号峰（苍术醇）、20号峰（和厚朴酚）、21号峰（厚朴酚）、16 号峰，表明上述峰的差异对分类的影响较大。详见图6。

图5 14批香砂平胃颗粒OPLS-DA得分散点图Fig.5 OPLS-DA scoring plot of 14 batches of Xiangsha Pingwei Granules

图6 共有峰VIP图Fig.6 VIP plot of common peaks

3 讨论

图6 显示，造成样品质量差异的5 个差异性标志物的色谱峰分别为7 号峰、9 号峰（苍术醇）、20 号峰（和厚朴酚）、21号峰（厚朴酚）、16号峰，其中20号峰和21号峰均来源于姜炙厚朴，9 号峰来源于炒苍术。因此，建议生产企业将苍术醇、厚朴酚、和厚朴酚作为内控指标纳入含量测定，并严格把关药材质量，以保证产品的均一性。

本研究中采用波长切换法建立了14 批样品的HPLC 指纹图谱，相似度值均>0.970，表明产品化学成分一致性较好。HPLC指纹图谱共标定23个共有峰，指认出其中7个共有峰，化学计量学分析将14批样品按生产年份聚为三类，表明不同年份样品间的质量存在一定差异，编号为S11-S14 中7 个成分的含量较低，可能与样品生产时间较长有关，可进一步考察产品稳定性。

综上所述，所建立的HPLC 指纹图谱结合化学计量学的方法可用于香砂平胃颗粒的质量控制，为该制剂质量标准的提升提供参考。