结直肠癌组织中P4HB的表达及意义

周颖，陆丽华，许琦华，廖冰灵

(上海中医药大学附属第七人民医院，上海 200137)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是一种死亡率较高的恶性肿瘤[1-3]，在我国消化道恶性肿瘤中排第三位，且发病率有持续升高的趋势。目前，CRC还没有特异性的肿瘤标志物可供检测[4]，因此，在早期的诊断上并不灵敏。脯氨酰4-羟化酶β亚基(prolyl-4-hydroxylase subunit beta，P4HB)是一种与内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)密切相关的蛋白。当内质网出现未折叠蛋白应答反应(unfolded protein response，UPR)时，P4HB的表达量会上调并且聚集在ER中[5]。近期有研究[6]表明，P4HB的表达上调与多种癌症的进展和临床状态相关。例如，在胶质瘤细胞中，恶性肿瘤中的P4HB表达有显著上调，同时P4HB的上调也导致胶质瘤细胞的耐药性增加[7-8]；在非小细胞肺癌中，P4HB的表达量越低，癌症的治疗效果越好[9]。这些结果提示，P4HB是一个潜在的致癌基因，并在肿瘤的发生、发展中起到重要的作用。目前有关P4HB的表达与结直肠癌之间的关系还未见明确的研究报道。本研究采集了部分临床结直肠癌组织样本，结合结直肠癌细胞系，关注P4HB的表达量，同时建立了P4HB表达量与临床疾病进展的关系。现报告如下。

1 材料与方法

1.1一般资料

选取上海中医药大学附属第七人民医院2015年1月至2018年6月收治的136例结直肠癌患者进行实验。其中，男性患者66例；年龄41～94岁，中位年龄68岁；<55岁患者6例，56～65岁患者17例，66～75岁患者22例，>75岁患者21例。女性患者70例；年龄29～90岁，中位年龄70岁；<55岁患者12例，56～65岁患者15例，66～75岁患者17例，>75岁患者26例。纳入标准：(1)未接受任何治疗的原发性结直肠癌患者；(2)无严重心肺功能障碍和其他严重合并症。排除标准：(1)已行放化疗及手术治疗者；(2)有其它恶性肿瘤史者。取患者肿瘤组织为实验组；癌旁组织为对照组进行后续检测。

1.2 细胞系及其培养

实验所用结直肠癌细胞系HT29、SW620、SW480、LOVO、HCT116、COLO 205、DLD-1等7种细胞系，人正常结直肠粘膜细胞FHC均为本实验室前期保存。所有细胞系均使用含10%胎牛血清(FBS;Invitrogen，USA)/100 U/mL青霉素(Invitrogen)和100 μg/mL链霉素的培养液(dulbecco modified eagle’s medium，DMEM)，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。

1.3 RNA的提取、反转录以及qPCR

将待测样本切小块约5 mg混合，每管约50 mg，采用TRI Reagent(Sigma Aldrich，T9424)RNA快速提取试剂提取组织总RNA，琼脂糖凝胶电泳验证质量后，进行反转录以及后续的实时定量PCR。采用反转录试剂盒(Promega，A5000)配置反转录体系20 μL，混合后水浴，进行反转录，反转录流程为42 ℃ 60 min、70 ℃ 15 min，产物备用。

按照20 μL配置反应体系，SYBR Green PCR Master Mix 10 μL(TOYOBO)、上下游引物各0.5 μL(10 μM)、反转录产物1 μL、ddH2O 8 μL。配置完成后，振荡器震荡均匀，加入八连管后，掌上离心机离心数秒再次混匀。实验所用qPCR引物见表1，序列来自Primer Bank，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4 样品总蛋白提取及Western Blot

细胞或样本加入适量RIPA裂解液后匀浆，冰上静置0.5 h后，12 000 rpm 4 ℃离心15 min，转移上清至新的1.5 mL EP管中。将30例患者样本每例取2 μL混合，振荡器震荡均匀后作为Western Blot检测样本。健康组织同上处理。向样品中加入15 μL 5×上样缓冲液，振荡器混匀后，置于沸水中水浴5 min，-20 ℃冰箱中保存待用。

表1 qPCR所用引物

取预制胶置于电泳缓冲体系中，每个样品上样15 μL，进行电泳，条件为浓缩胶20 mA，分离胶35 mA。电泳结束后，把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上，条件为100 mA 40 min。将转移结束的膜置入5 %牛奶中封闭1 h，孵育一抗过夜。洗膜，孵育二抗，孵育结束后洗膜，进行显色反应，暗室中以X光片进行成像。所用一抗采购于Abcam公司，P4HB抗体的货号为ab2792。1.5样本采集及免疫组织化学检测

患者一旦确诊即采集肿瘤组织及癌旁组织。组织标本使用福尔马林固定，然后按照标准程序进行石蜡包埋(常温储存)并进行病理确诊。常规石蜡组织切片，厚3 μm，衬于涂胶玻片上，放置烤箱中(65 ℃)烘烤过夜；组织切片经二甲苯脱蜡3 min×3次，100%、95%和75%的酒精脱水各2 min，自来水冲洗2 min；3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶，浸泡10 min，PBS冲洗3 min×3次；EDTA 抗原修复：不锈钢锅内加入配制好的EDTA缓冲液，电磁炉上加热至煮沸，将切片置于耐高温塑料切片架中，浸入已沸腾的缓冲液中，盖好加压阀，保温20 min，停止加热，不锈钢锅自然冷却2～3 min，自来水冲洗冷却至室温，打开锅盖，取出切片，水洗2 min，PBS冲洗3 min×3 次；IHC油笔在组织外围划圈，防止滴加的抗体流失；滴加第一抗体(HER2抗体，抗体浓度1∶150)，以PBS缓冲液替代第一抗体，作为空白对照，37 ℃湿盒内孵育2.5 h(或过中午)，PBS冲洗3 min×3次；甩去PBS溶液，滴加即用型二抗，室温孵育30 min，PBS冲洗 3 min×3 次；滴加新鲜配制的DAB显色液，镜下控制显色时间1～3 min，不超过5 min，水洗2 min；改良无酒精Carazzi苏木素液复染数秒，流水洗5 min；显色片过酒精后烤干，用中性树胶封片，显微镜下观察。

根据修订的 Hercep Test 评分系统进行评分：无着色/少于10%肿瘤细胞有着色(0/阴性)；>10%的肿瘤细胞呈现微弱、不完整着色(1+/阴性)；>10%的肿瘤细胞呈现弱至中度完整/基底侧着色(2+/阳性)；>10%的肿瘤细胞呈现强的、完整/基底侧着色(3+/阳性)。IHC 判读的辅助方法(放大倍数规则)：裸眼或低倍镜下(2.5×/5×)可见强着色为3+；中倍镜下(10×/20×)可见弱/中等强度着色为2+；高倍镜下(20×/40×)着色隐约可见为 1+；高倍镜下(40×)无着色则为阴性。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 结直肠癌细胞中P4HB表达情况

首先检测了7种结直肠癌细胞系HT29、SW620、SW480、LOVO、HCT116、COLO205、DLD-1，与人正常结直肠黏膜细胞FHC中P4HB的转录情况，结果见图1。研究发现，在7种结直肠癌细胞系中，P4HB的转录水平均有不同程度的上调，为1.8～5倍，最高的为SW480细胞系。

采用Western Blot的方法检测了7种结直肠癌细胞系HT29、SW620、SW480、LOVO、HCT116、COLO205、DLD-1与人正常结直肠黏膜细胞FHC中P4HB的表达情况，见图2A。研究发现，P4HB在结直肠癌细胞系中均有高表达，而在FHC这一正常细胞系中表达较低。经过灰度扫描比对(图2B)，可以直观地看到P4HB在不同的结直肠癌细胞系中的表达量约为正常细胞的2～5倍，最高的为SW480细胞，可达4.9倍。Western Blot的结果与qPCR的结果符合的较好，说明在结直肠癌细胞系中P4HB表达上调。

2.2 结直肠癌组织中P4HB表达情况

根据2.1中研究可推断P4HB在结直肠癌患者中可能也有高表达的情况，为了验证这一猜测，本研究检验了2017年至2018年6月收治的42例结直肠癌患者肿瘤组织样本及其癌旁组织样本，进行qPCR检测，见图3。此处将相对表达倍数>1.4倍的样本认为P4HB高表达。可见结直肠癌患者的癌症组织中P4HB高表达，差异有统计学意义(P<0.001)。42例癌旁组织中，检测结果并未发现高表达；42例患者肿瘤组织中，高表达的样本有28例，不满足高表达条件的肿瘤样本有14例，最高相对表达量为对照癌旁组织的10倍左右。

采用Western Blot的方法检测了6例结直肠癌患者的新鲜肿瘤组织与2例癌旁组织中P4HB的表达情况，见图4A。研究发现，P4HB在结直肠癌患者的肿瘤组织中均有高表达，而在癌旁组织中表达较低。经过灰度扫描比对(图4B)，可以直观地看到P4HB在结直肠癌患者的新鲜肿瘤组织的表达量约为癌旁组织的2倍。Western Blot的结果与qPCR的结果符合的较好，说明在结直肠癌肿瘤组织中P4HB表达上调。

2.3 P4HB表达与患者临床特征的关系

将136例患者的病理切片进行Hercet评分，得分>2分的患者定义为P4HB高表达。然后，检验P4HB表达情况与患者临床特征的关系，分别验证了性别、年龄和癌症分化程度3个因素。检验结果见表2。从表中分析的结果可知，性别因素与P4HB的高表达无关，χ2=0.064，P=0.800，差异无统计学意义；年龄因素与P4HB的高表达无关，χ2=0.026，P=0.873，差异无统计学意义；肿瘤分化程度与P4HB的高表达相关，中分化和高分化癌症患者P4HB高表达的例数显著上升，χ2=14.931，P=0.001，差异有统计学意义。

表2 P4HB表达与临床特征的关系

3 讨论

本研究发现，P4HB在结直肠癌中显著高表达，且与肿瘤的分化程度密切相关，是潜在的结直肠癌诊断标志物。P4HB在结直肠癌组织中的高表达可能是由于肿瘤微环境的恶劣引起的。肿瘤细胞常常暴露在营养缺乏以及缺氧的环境下，这一条件将会导致内质网应激(ERS)的出现，触发防御机制UPR，从而保证肿瘤细胞在ERS下的生存[10]。多篇文献[11]报道ERS导致UPR发生，而UPR的发生将导致P4HB表达的上调[12]。P4HB是一种重要的ER分子伴侣，传统上认为其主要功能是负责ER中蛋白质的翻译后修饰，在调节细胞增殖、凋亡和免疫方面至关重要[13]。由于ER与其他多种细胞器相连，ER的分子伴侣可以在ER外对肿瘤细胞的信号通路进行作用[12,14]，改善肿瘤生存状况。从这些已经报道的结果中猜测，P4HB是结直肠癌细胞耐受免疫环境、维持增殖和分化的重要分子，是潜在的致癌靶点。P4HB在结直肠癌的发展、分化、迁移和侵袭中发挥重要作用，可以通过过表达/敲减的方法进一步验证。同时，建立P4HB表达与病人预后也是下一步的研究目标。

在本研究中，结直肠癌患者的癌症组织P4HB有高表达，并且与肿瘤的恶性分化密切相关，可以作为结直肠癌诊断和治疗过程中潜在的分子标志物。这可能是由于高分化/中分化的结直肠癌肿瘤细胞在缺血、缺氧的环境诱导下，出现了严重的ERS反应，导致P4HB表达的增加，改善了肿瘤细胞对环境的耐受性，缓解了ERS带来的不良影响，进一步分化。