趋化因子与SP-D在持续性慢性鼻炎发病中的作用机制研究

马鹏，冯俊，彭涛

(川北医学院第二临床医学院·南充市中心医院耳鼻咽喉头颈外科，四川 南充 637000)

慢性鼻炎为耳鼻喉科的常见病、多发病，但其病因至今仍未完全明确。近年来，对该病发病机制的研究多认为是多因素、多基因、多信号途径共同作用的结果[1]。肺表面活性蛋白D(surfactant protein D，SP-D)表达于肺部下呼吸道，肺特异性较为显著，其参与了肺组织局部免疫，能够维持肺泡表面的稳定性。目前，越来越多的研究[2]发现，SP-D能够下调炎症因子，在炎症发生过程中起着重要的作用。趋化因子白介素16(interleukin 16，IL-16)作为一种炎症细胞因子，可参与机体炎症反应的发生发展。另有研究[3]表明，SP-D、IL-16在鼻炎伴鼻息肉患者的鼻窦黏膜中呈高表达，但其与持续性慢性鼻炎的关系却尚未明确。本研究采用免疫组织化学方法(SP法)检测持续性慢性鼻炎患者的鼻粘膜组织中SP-D及IL-16的表达及分布情况，借以探究其在持续性慢性鼻炎发病中的作用及意义。

1 资料和方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 选择2016年10月至2017年10月在南充市中心医院耳鼻咽喉科住院的单纯鼻中隔偏曲患者(对照组)和鼻中隔偏曲伴持续性慢性鼻炎患者(研究组)各30例。对照组中，男性17例，女性13例，年龄16～50岁，平均(32.29±4.64)岁；研究组中，男性18例，女性12例，年龄16～50岁，平均(31.50±4.81)岁。两组的年龄、性别等基本资料未见有统计学差异(P>0.05)。纳入本研究的两组患者均经过术前鼻内窥镜检查及鼻窦CT检查确诊，并排除伴有感染性疾病、凝血功能障碍或术前1个月曾服用抗生素、抗组胺药物、糖皮质激素的患者。患者签订同意书后，在局麻或全麻下行鼻内窥镜下鼻中隔偏曲矫正术，术后采集其部分下鼻甲黏膜组织作为实验标本。

1.1.2 实验材料 IL-16单克隆抗体(上海信裕生物科技有限公司)；兔抗人SP-D单克隆抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司)；DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；兔SP检测试剂盒(SP-9001)免疫组化试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 标本处理 将术中采集的下鼻甲黏膜组织选为实验标本，用生理盐水对其进行反复冲洗，随后加入适量10%多聚甲醛溶液将标本固定24 h。固定完成后，用自来水将标本反复冲洗1 h，并分别加入浓度70%、85%、95%、100%酒精进行梯度脱水。同时，选用二甲苯为透明剂透明2次，每次透明30 min。然后，将透明后的标本进行浸蜡、包埋和切片，并贴附在载玻片上，置于60 ℃烤箱中进行烘烤2 h，取出并放置于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 常规苏木精-伊红染色(HE染色) (1)取出备用标本用二甲苯脱蜡，反复进行2次，每次大约5～10 min；然后分别加入浓度为100%、95%、85%、75%的酒精浸润10 min，再用蒸馏水反复冲洗2 min；(2)向标本中加入适量苏木素进行染色，每次5～10 min；(3)用自来水冲洗3 min；(4)加入盐酸乙醇分化液(1%)浸润分化30 s；(5)用自来水冲洗5 min；(6)再用0.5%淡氨水浸润处理30 s，并用自来水冲洗5 min；(7)将标本玻片加入到0.5%伊红溶液中染色3 min；(8)用蒸馏水对其进行冲洗1 min；(9)分别加入浓度为95%、90%、80%、75%的酒精进行梯度脱水l0 min，并用二甲苯对其进行透明15 min。最后，用中性树脂封片。

1.2.3 免疫组化(SP法) (1)脱蜡脱水：将备用的标本玻片放置到60 ℃的烤箱中进行烘烤30 min，并采用二甲苯脱蜡再进行梯度酒精脱水；(2)抗原修复：应用PBS缓冲液对将玻片反复洗涤3次，每次5 min，随后加入抗原热修复液进行10 min的加热修复，冷却，再用PBS冲洗3次，每次5 min；(3)血清封闭：在每个载玻片上加入50 μL的山羊血清工作液以对其进行封闭处理，并在常温下加入内源性生物素封闭20 min，甩除勿洗；(4)分别滴加一抗(兔抗人SP-D单克隆抗体和IL-16单克隆抗体)，放置在4 ℃冰箱中。24 h后取出将其置于常温环境中，用PBS液冲洗3次，每次耗时5 min；(5)滴加二抗：在每张载玻片上滴加50 μL二抗工作液，置于37 ℃中孵育30 min，并用PBS冲洗3次，每次约为5 min；(6)滴加三抗：在每张载玻片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，置于37 ℃中孵育30 min。用PBS冲洗3次，每次约5 min；(7)显色：在载玻片上滴加适量的DAB显色剂，使其在常温下显色，并在显微镜下调整其显色情况，直至显色适度为止，用自来水对其进行冲洗3 min以终止显色反应；(8)复染：用苏木素复染2～3 min，再用自来水冲洗终止。随后采用1%盐酸乙醇分化，再用自来水冲洗10 min；(9)封片：取适量二甲苯作脱蜡透明处理，并加入不同浓度的酒精作梯度脱水，最后再用中性树胶作封片处理。与此同时，取适量PBS缓冲液代替一抗进行阴性对照。

1.2.4 结果判定 (1)HE染色结果判定：嗜酸性粒细胞的细胞核有蓝色的单核或双核，胞质中呈粉红色，故可通过观察细胞是否呈“红质蓝核”来判断嗜酸性粒细胞的浸润状况。每张玻片标本均在高倍镜、低倍镜中选取5个视野进行观察，并选取典型图片拍照。(2)免疫组化结果判定：SP-D和IL-16在免疫组化实验中呈棕黄色颗粒，且可布满阳性细胞。待观察到棕黄色颗粒后，需在显微镜下观察其在阳性细胞中的表达部位，并能够随机选取5个显微视野应用Biosens Digital Imaging System(V1.6)图像分析系统测量每张玻片中SP-D、IL-16阳性细胞的吸收度(A值)平均值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 苏木精-伊红染色结果

研究组标本中可见组织黏膜下有毛细血管扩张和腺体增生，尤以大量的嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润为主要表现(图1)。而对照组的标本中仅可见有少量的炎性细胞表达(图2)。经比较发现，研究组中含有的嗜酸性粒细胞计数平均为(15.59±2.86)个/HP，较对照组的(1.93±0.46)个/HP要多，差异具有统计学意义(t=25.807，P=0.001)。

2.2 免疫组化结果

研究组中的SP-主要表达在标本组织的细胞质中，尤以黏膜下腺体细胞、纤毛上皮细胞以及炎性细胞的胞质最为显著(图3)，但在对照组中仅见有少量的SP-D表达，且多分布在细胞间质(图4)。至于IL-6，其在研究组中主要分布于黏膜下腺分泌体细胞、鼻粘膜组织的纤毛上皮细胞、炎症细胞的细胞质中(图5)；而在对照组中极少见有IL-6阳性表达，仅部分散在性地分布在细胞间质中(图6)。经计算发现，研究组鼻粘膜组织中的SP-D、IL-16阳性表达均显著高于对照组(P<0.05)。见表1。此外，经Person相关性分析发现，研究组患者中血清SP-D、IL-16水平呈正相关(r=0.715，P=0.001)。

表1 SP-D、IL-6在两组标本组织中的阳性表达比较

3 讨论

慢性鼻炎就是鼻粘膜及粘膜下层的一种慢性炎症，主要由鼻窦黏膜上皮细胞及T细胞介导，通过细胞因子、趋化因子及炎性介质对促炎细胞进行激活，进而导致腺体增生、炎症细胞浸润、黏蛋白分泌异常、组织重塑等病理改变[4]。有研究[5-6]指出，细胞趋化因子可使相关未成熟的炎症细胞分化为成熟细胞，并促使其迁移和聚集到鼻粘膜上释放大量的炎性介质，其中，嗜酸性粒细胞是炎性介质的主要释放来源。与此同时，多种炎性细胞浸润在鼻粘膜就会导致慢性炎症，而慢性炎症的发生又可导致鼻粘膜组织重塑，进而使炎症加重，此为持续性慢性鼻炎迁延不愈的主要原因。

相关文献[7]也报道，在持续性慢性鼻炎发病过程中Th2辅助细胞能够调节中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等炎症细胞的活性，使得炎性细胞大量浸润在鼻粘膜中。本研究行常规苏木精-伊红染色实验发现，研究组中含有的嗜酸性粒细胞计数(15.59±2.86)个/HP，较对照组的(1.93±0.46)个/HP显著增多，提示持续性慢性鼻炎组织中有大量的嗜酸性粒细胞浸润。Berrettini等[8]通过研究慢性鼻炎儿童的嗜酸性粒细胞的浸润状况，发现嗜酸性粒细胞的表达水平高低可成为临床预测儿童慢性鼻炎病情发展的一项重要因素。现代药理学研究也报道[9]，孟鲁司特能够通过减轻嗜酸性粒细胞的浸润来改善慢性鼻炎患者的症状。由此可知，嗜酸性粒细胞在持续性慢性鼻炎发生、发展中起着重要的作用。

SP-D是胶原凝集素家族中的一种蛋白质，主要由呼吸道表面的Clara细胞和肺泡细胞分泌，具有维持肺泡表面稳定的作用，并可通过下调炎症反应发挥一定的免疫调节作用。近年有研究[10]发现，除了肺脏，SP-D还可广泛分布在鼻腔-鼻窦黏膜、咽鼓管黏膜、胸膜、肠系膜等部位。Schicht等[11]研究发现，人类下鼻甲黏膜中存有表面活性蛋白的前提形式—板层体，其在维持鼻部正常生理功能中起着重要的作用。Lin等[12]的研究也显示，在慢性鼻窦炎患者的鼻粘膜组织中含有大量的板层小体，其可调节鼻腔鼻窦中分泌物的粘滞度。IL-16属于一种T细胞趋化剂，同时也是一种前炎症细胞因子，由多种炎性细胞合成分泌的具有典型的调节免疫和介导炎症等作用。

本研究结果显示，研究组鼻粘膜组织中含有的SP-D、IL-16阳性表达水平较对照组显著升高，且在鼻中隔偏曲伴持续性慢性鼻炎患者中血清SP-D、IL-16水平呈正相关，笔者分析其原因，可能是鼻腔为呼吸道的起始段，最先接触到外界空气中的颗粒病原体等物质，可刺激鼻腔黏膜表面的SP-D大量分泌，同时通过趋化活化嗜酸性粒细胞促使多种促炎因子积聚参与到炎症反应过程，使得鼻腔-鼻窦黏膜的血管通透性显著升高，黏膜组织结构水肿。而IL-16作为一种T淋巴细胞趋化剂和前炎性细胞因子，在持续性慢性鼻炎发病过程中能够激活CD4+T细胞是IL-5、IL-4等炎症细胞因子释放，进而加重鼻腔黏膜炎症反应的程度，促使慢性鼻炎发展。因此，本研究可认为，SP-D和IL-16是持续性慢性鼻炎病变中重要的嗜酸性粒细胞趋化因子，且可增强嗜酸性粒细胞的局部作用，共同参与持续性慢性鼻炎的病变过程。

综上所述，趋化因子IL-16与SP-D在持续性慢性鼻炎组织中呈高表达，其可能是通过动员并聚集大量促炎因子使机体维持非可控的炎症环境，故在持续性慢性鼻炎发病机制中可能发挥了重要的作用。