优化后精液孵育时间对精子DNA完整性、顶体反应率及IUI临床结局的影响

彭洁，易兵，戚青林

（江西省萍乡市妇幼保健院，萍乡337000）

精液优化是辅助生殖技术中男性精子优选的重要手段，但优化过程的操作时间及力度、离心力、离心时间等因素均可造成精子DNA损伤[1]。采用密度梯度法优化精液大概耗时40-60min，优化后精液经孵育后行IUI手术，但是孵育时间的长短及与临床结局的关联还不明确，缺乏相关指南及标准。优化后的的精子具有运动活跃、浓度高的特点，孵育后可促进精子的获能[2]，有利于受精，但精子碰撞及ROS水平均增多，反而可能促进DNA损伤及自发顶体反应的发生，因此确定获得最佳临床结局的孵育时间阈值具有重要意义。本研究旨在探讨IUI精液优化后孵育时间的最佳范围。

1 资料与方法

1.1 一般资料 对2016年1月-2019年1月萍乡市妇幼保健院生殖医学科完成的IUI周期进行回顾性分析。纳入标准：⑴女方年龄＜35岁；⑵进入IUI周期前筛查精子DNA碎片率（DFI）＜30%，精子自发顶体反应率（AR）＜10%；⑶采用非连续密度梯度法优化精液，优化后PR总数≥5×106。排除标准：采用上游法处理；优化后PR总数＜5×106；女方年龄＞35岁。最终纳入168个IUI周期，其中促排卵周期122个，自然周期46个；男方年龄(33.02±4.70)岁，女方年龄(30.94±2.03)岁。收集优化后精液孵育时间、临床妊娠、自然流产及活产等资料，并分析优化后精液孵育时间与精子DFI、自发AR率及IUI临床结局的相关性。

1.2 方法

1.2.1 精液优化方案 采用非连续密度梯度离心法：包括梯度液配置、加样、分离、洗涤等步骤。梯度液（SAGE）配置：上层1.5ml 40%梯度液+下层1.5ml 80%梯度液，加样：在40%梯度液上方加入1.5ml完全液化的精液，分离：400g离心20min，洗涤：沉淀转移至4ml精子洗液，200g离心5min，沉淀加入适量G-IVF，最终体积0.6ml，37℃孵育备用，并记录孵育时间（即从精液优化完成后至送入宫腔前的时间间隔）。

1.2.2 精子DNA碎片检测 分别收集精液优化完成、孵育完成时的两份标本各20μl用于精子DNA碎片的检测。试剂盒采用安科生物《精子DNA碎片检测试剂盒》。精子DNA碎片检测采用SCD法，包括制片、变性、裂解、洗涤、脱水、染色等步骤。400光学显微镜计数。精子DNA碎片指数（DFI）=（小晕环精子数+无晕环精子数）/计数精子总数×100%。

1.2.3 精子自发顶体反应检测 分别收集精液优化完成、孵育完成时的两份标本各20μl用于精子自发顶体反应的检测。试剂盒采用安科生物《精子自发顶体反应检测试剂盒》。精子自发顶体反应检测采用PSA-FITC染色，包括制片、固定、染色、荧光显微镜观察等步骤。用450-490nm激发光，于400倍镜下观察并计数精子200条以上。顶体完整（AI）：精子头部一半以上荧光染色明亮且均匀；已发生顶体反应（AR）：精子仅在赤道带出现荧光带或者顶体区没有荧光染色；顶体异常：除上述两类精子外的所有精子，该类精子不计数。自发顶体反应率=AR精子数/计数精子总数×100%。

1.3 统计分析 采用SPSS17.0统计分析数据，计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验；计量资料采用()表示，组间比较采用独立样本t检验。多组间比较则采用单因素ANOVA分析。均以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 优化后精液孵育时间对精子DFI的影响 与孵育前比较，孵育46-60min、61-90min、91-120min后的精子DFI均显著升高 （P＜0.05）。单因素ANOVA分析结果显示，孵育前各组精子DFI比较均无统计学差异（P＞0.05）；孵育后各组精子DFI比较有统计学差异（F=5.516，P=0.000），孵育61-90min、91-120min组的精子DFI均显著高于0-15min、16-30min、31-45min、46-60min组(P＜0.05)，见表1。

2.2 优化后精液孵育时间对精子自发顶体反应率的影响 与孵育前比较，孵育46-60min、61-90min、91-120min后的精子自发AR率均显著升高（P＜0.05）。单因素ANOVA分析结果显示，孵育前各组精子自发AR率比较均无统计学差异（P＞0.05）；孵育后各组精子自发AR率比较有统计学差异（F=7.424，P=0.000），61-90min、91-120min的精子自发AR率均显著高于0-15min、16-30min、31-45min、46-60min（P＜0.05），见表2。

2.3 优化后精液孵育时间对IUI临床结局的影响当孵育时间0-45min时，临床妊娠率逐渐升高，31-45min妊娠率最高；孵育时间46-120min时，临床妊娠率逐渐下降，但各组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。各组自然流产率、活产率比较也均未见统计学差异（P＞0.05），见表3。

表1 优化后精液孵育时间对精子DFI的影响

表2 优化后精液孵育时间对精子自发顶体反应率的影响

表3 优化后精液孵育时间对IUI临床结局的影响(%)

3 讨论

精子获能是指成熟精子经过一系列生理生化变化获得受精能力的过程，人工授精的精子主要通过体外途径获能，因为系列精子洗液、受精液中均含有葡萄糖、乳酸盐、丙酮酸盐和白蛋白等能量物质，在体外37℃孵育适当时间可完成精子获能[3]。体外孵育虽然有利于精子获能，但也可能会造成精子损伤，因为优化后的精子浓度及活力均较高、多呈直线运动、且运动速度快，极大地增加了精子的碰撞机率、能量损耗及ROS水平，损伤精子DNA、RNA、蛋白质和脂质成分，从而影响精子的受精能力[4]。本研究结果显示，孵育后精子DFI、自发AR率随时间增长呈逐渐升高趋势，孵育0-45min对精子DFI及自发AR率并无明显影响；而孵育46-120min时，精子DFI及自发AR率显著高于孵育前，与梁嘉颖[5]等报道的正常、少、弱、畸形精子症患者优化后精液孵育40min后精子质量显著降低的结果类似。Enkhmaa[6]等研究显示随孵育时间增长（1h、4h与18h）ROS水平逐渐升高，提示高浓度精子产生大量的ROS，可能是导致DNA损伤及精子质量下降的重要原因。在体外获能培养液中，自发AR率随孵育时间延长呈依赖性增长，而发生自发顶体反应的精子则丧失了受精能力，导致受精率降低。段彪[7]等研究显示优化后精液获能1h时的IVF受精率显著高于2h及4h，华月琴[8]等研究显示优化后精液获能0.5h时可获得最好的IVF受精率，提示孵育获能0.5-1h有利于精卵受精，可能与精子自发顶体反应率较低有关，与本研究结果类似。

此外还发现孵育时间31-45min时IUI临床妊娠率最高，但各组妊娠率、自然流产率及活产率比较均无统计学差异，与梁嘉颖[9]等报道的优化后精液孵育20-39 min IUI临床妊娠率最高类似。FAUQUE[10]等研究也显示优化后精液孵育40-80min可获得最高的临床妊娠率。可能原因为孵育时间过短可导致精子染色体解凝度降低[11]，过长则促进精子DNA损伤及自发顶体反应率的发生，降低精子受精能力，孵育31-45min可能是获得IUI妊娠的适宜时间。此外，本研究发现孵育时间46-120min时，自然流产率呈逐渐升高趋势，但差异无统计学意义。精子DNA碎片率高是导致自然流产的主要男方因素，孵育时间过长导致精子DNA损伤加剧，可能是IUI流产率升高的原因，样本量少可能是导致临床结局数据无统计学差异的原因。

综上所述，精液优化后孵育时间越长，对精子DNA完整性及精子受精能力均会产生不利影响，但临床结局变化并不明显，这可能与样本量较少有关。关于IUI精液优化后孵育时间对精子功能及临床结局的影响，仍需多中心大样本的研究，从而发现获得最佳临床结局的孵育时间阈值，有利于各生殖中心IUI实验室精液获能条件的标准化。