冷鲜滩羊肉贮藏中菌体蛋白质与微生物群落演替的关联性分析

赵晓策，胡倩倩，罗瑞明*，张赫宇

（宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021）

动物被宰后，活体的生长代谢也同时停止，但由于机体呼吸与血液循环中断，肌细胞内的各种需氧性生化反应停止，代谢与活体产生差异。冷鲜肉在贮藏过程中，贮藏温度一直控制在0～4 ℃，能抑制表面大部分的嗜温菌与致病菌的生长，而对嗜冷细菌的影响并不明显[1]，所以冷鲜肉依旧会被外源性微生物污染，导致肉品腐败变质[2]，使得环境中的菌落总数、pH值、挥发性盐基氮值随贮藏时间的延长发生变化，蛋白质的种类和含量也发生变化[3]，而微生物生长繁殖因为蛋白质的不同开始相互竞争，最后能适应一切不利的生长环境，且对肉品变质发挥主要作用的微生物只有一小部分[4-6]。蓝蔚青等[7]及刘朏[8]在研究冷却肉时，均检验出其在贮藏过程中的优势菌为假单胞菌属、热死环丝菌、气单胞菌属，然而若初始菌相中存在葡萄球菌，它会逐步跃升为优势菌。其中假单胞菌成为肉品腐败优势菌的原因主要是：假单胞菌可以利用肉品在代谢过程中产生的葡萄糖，从而使假单胞菌的滋生能力优于其他竞争性菌群。Gill等[9]研究发现，假单胞菌的生长速率和数目与其他细菌相互作用关系不显著。于见亮[10]发现假单胞菌的含量最高，几乎达到了菌落总数的对数值；并随着贮藏时间的延长，数目不停上升，一直是优势菌。而宏基因组学[11]作为一种新的微生物研究方法，逐渐代替了变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、单链构象多态性、末端标记限制性片段长度多态性等技术，为全面认识其群落水平上的生态学意义和功能创造新的路径。深入探究这些优势菌的种类、生长状态及代谢过程，在解决肉类腐败变质问题时可做到对症下药[12-13]。

本实验以贮藏过程中的冷鲜滩羊肉为研究对象，采用组合蛋白芯片与表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（surface enhanced laser desorption ionization time-of-f l ight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）平台对冷鲜滩羊肉贮藏过程中的微生物蛋白质进行检测，找出与其有关联的19 个菌体蛋白质，并结合宏基因组测序的方法[3]分析细菌多样性，找出贮藏时期的优势菌。使用主成分分析（principal components analysis，PCA）及热力图分析研究微生物差异蛋白质与菌落演替的关联性，找出优势菌与微生物菌体蛋白质之间的关系，对冷鲜滩羊肉贮藏过程中微生物调控及其微生物群落演替驱动机制的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜滩羊后腿肉，购自于宁夏大夏牧场食品有限公司（滩羊饲养期间不做任何生物性防疫工作，且定期进行清粪、消毒处理），当天屠宰后立刻放入冷藏箱，运回实验室后迅速放入-20 ℃冰箱1 h，使其中心温度降至0 ℃，托盘密封包装后将其取出置于0 ℃冰箱贮藏。

核糖核酸酶A、溶菌酶、S缓冲液、DV-A缓冲液、W2浓缩缓冲液、洗脱剂（均为分析纯） 上海百赛生物技术有限公司；无水乙醇、甘油、异丙醇、异丁醇（均为分析纯） 银川泰丰生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Sorvall Legend Micro 17型常温离心机 美国Thermo公司；vortex-genie2 G-560E型旋涡混合仪 美国SI公司；SPECTRAMAX PLUS384型酶标仪 美国MD公司；移液器 德国Eppendrop公司；JT-C型均质器漯河市金田试验设备研究所；ZHWY-1102C型摇床中国智诚公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

无菌条件下，将滩羊后腿肉分割成大小相等的5 块，保鲜膜密封包装，放在0 ℃冰箱，采集贮藏0、4、8 d滩羊肉表面刮擦物150 mg，表面刮擦物含微生物、血液、肉汁液等[1]，每组样本做5 个平行。

1.3.2 冷鲜滩羊肉微生物菌体差异蛋白质的获取

胡倩倩等[14]采用组合蛋白芯片与SELDI-TOF-MS平台对0、4、8 d的冷鲜滩羊肉表面微生物菌体蛋白质进行了分类总结，本研究采用同样的方法分析菌体蛋白质在贮藏过程中的变化规律。

1.3.3 宏基因组测序法分析冷鲜滩羊肉微生物群落演替过程中的优势菌

张赫宇[3]通过宏基因组技术对冷鲜滩羊肉中0、4、8 d微生物进行DNA提取→16S rDNA PCR扩增→Illumina MiSeq测序的统计分析，得到了滩羊肉中表面腐败菌随贮藏时间变化而显示出的群落组成、丰度结构以及多样性。本研究采用同样的方法通过对菌群组成分析，剔除变异系数（标准偏差/平均值）大于15%的样品[15]，研究滩羊肉贮藏过程中的优势菌及其变化规律。

1.4 数据处理

采用Origin 2017对冷鲜贮藏期为0、4、8 d滩羊肉的优势菌和菌体差异蛋白质的变化规律进行总结分析。利用R软件的Pearson算法和SIMCA软件（V14.1, MKS Data Analytics Solutions, Umea, Sweden）对随贮藏时间变化的菌体蛋白质峰面积平均值和表面主要腐败优势菌菌数量进行热力图分析和PCA，研究冷鲜滩羊肉表面微生物差异蛋白质与微生物群落变化的关联性。

2 结果与分析

2.1 冷鲜滩羊肉宏基因组分析确定优势菌及其变化规律

图1 冷鲜滩羊肉贮藏中的细菌群落分布图Fig. 1 Distribution of bacterial communities in fresh and chilled Tan sheep meat

从图1可知，第0天时，假单胞菌（Pseudomonas）、不动杆菌（A c i n e t o b a c t e r）、微小杆菌（Exiguobacterium）、气微菌（Aeromicrobium）、葡萄球菌（Staphylococcus）、芽孢杆菌（Bacillus）等占大部分，其中假单胞菌为9.98%，不动杆菌为19.15%，微小杆菌为6.18%，气微菌为9.84%，成为冷鲜滩羊肉贮藏第0天的优势菌。这与周琰冰等[16]采用DGGE技术对0 ℃托盘包装的冷鲜羊肉菌相分析，得出假单胞菌、芽孢杆菌和不动杆菌属在冷鲜羊肉贮藏初期为优势菌研究结果基本一致。与刘莹莹等[17]采用传统方法对冷却羊肉的初始菌相探究，得出致腐菌为假单胞菌、肠杆菌、乳酸菌、葡萄球菌的研究结果一致。

冷鲜滩羊肉样品贮存4 d时，假单胞菌、热死环丝菌（Brochothrix）、埃希氏菌（Escherichia）、乳酸杆菌（Lactobacillus）、梭菌（Clostridium）等占据优势。其中假单胞菌迅速增长，从最初的9.98%增长到20.06%，并成为此时的优势菌。热死环丝菌为12.43%，埃希氏菌为10.62%，梭菌为7.31%、乳酸杆菌为6.01%，成为冷鲜滩羊肉贮藏第4天的优势菌。第8天优势菌的相对含量分别为假单胞菌33.70%、热死环丝菌23.98%、埃希氏菌11.40%、乳酸杆菌7.54%。

假单胞菌到第8天时成为主要优势菌，这是由于假单胞菌是一种需氧杆菌，冷藏条件下快速生长。托盘包装下的假单胞菌首先将葡萄糖作为生长基质，当葡萄糖含量较低无法支撑其反应，则将氨基酸作为生长基质，产生氨等腐败产物[18]。假单胞菌是贮藏第8天时的优势菌，也是滩羊肉贮藏过程中主要腐败菌。这与国内外对冷鲜羊肉中菌相变化研究一致。诸永志等[19]研究发现托盘包装冷鲜羊肉中假单胞菌在贮藏第8天时比例为72.86%。热死环丝菌虽然在贮藏初期占有的比例不大，但是迅速增长，到第8天时占总数的23.98%。由于热死环丝菌是一种兼性厌氧微生物，托盘包装冷藏下热死环丝菌利用葡萄糖作为基质，将其分解为乙酸和已偶姻，同时还可以将亮氨酸和缬氨酸分解变成异戊酸和异丁酸。傅鹏等[20]对托盘包装冷却猪肉的探究中同样得出，热死环丝菌在初始菌相中所占的数量不多，但随着贮藏时间的延长而快速增长的结果。

通过对冷鲜滩羊肉微生物多样性的研究结果显示，随着放置时间的延长，微生物菌落总数呈明显增长的趋势，前8 d增长趋势平稳，到第8天菌落总数对数值到达106CFU/g，之后菌落总数快速增大，超过106CFU/g[21-22]，说明此时的冷鲜滩羊肉腐败变质，8 d后的冷鲜滩羊肉不存在微生物含量检测意义。而在有效贮藏过程中的优势菌有假单胞菌、热死环丝菌、埃希氏菌和乳酸杆菌等。

2.2 冷鲜滩羊肉贮藏过程中菌体蛋白质的变化规律

图2 冷鲜滩羊肉贮藏过程中菌体差异蛋白变化规律Fig. 2 Changes in differential bacterial proteins from fresh Tan sheep meat during chilled storage

如图2所示，共12 个菌体蛋白质随着贮藏时间的变化而明显上升或下降，且变化幅度较大。其中坏死诱导疫霉蛋白质（M8414-05）、NADH-泛醌氧化还原酶链4L（M10880-9）、生长抑制素-28（M3130-58）、ATP合酶F（0）复合体亚基C1（M7668-64）、朊蛋白质类（M9074-86）、角蛋白质关联蛋白质8-1（M6658-62）、抗菌肽（M7451-79）及磷载脂蛋白质C-II（M8136-55）随着贮藏时间的延长，其所占比例有大幅度上升；与此同时，角蛋白质关联蛋白质3-1（M10359-3）、GRF/GHRH 生长激素释放素（M5109-45）、ATP合成蛋白质（M7709-26）、载脂蛋白质E（M34203-3）随贮藏时间的延长，其所占比例有在下降，表明在贮藏过程中这部分菌体蛋白质和微生物生长繁殖有关。

2.3 冷鲜滩羊肉菌体差异蛋白质与微生物群落演替的关联性分析

将12 个菌体蛋白质与宏基因组测序得到的优势菌假单胞菌、热死环丝菌、埃希氏菌和乳酸杆菌进行关联性分析。

2.3.1 PCA

利用SIMCA软件对不同菌群及差异蛋白质数据进行对数转换加中心化格式化处理，然后进行自动建模分析[23-25]。PCA模型的相关参数见“PCA模型参数”：选取SIMCA软件建模的模型编号M01；SIMCA的模型类型PCA-X；模型的主成分2 个，分别表示差异蛋白质和菌群；模型的观测个数23 个，包括筛选出的19 个差异蛋白质和4 个优势菌；R2X(cum)为0.918，代表模型对X变量（差异蛋白质）的解释性；R2Y(cum)为0.875，代表模型对Y变量（优势菌）的解释性[26-28]。

图3 差异蛋白质-优势菌的PCA得分散点图Fig. 3 PCA score scatter plot for differential proteomics and dominant bacteria

从图3可得，假单胞菌、热死环丝菌与差异蛋白质坏死诱导疫霉蛋白质（M8414-05）、NADH-泛醌氧化还原酶链4L（M10880-9）、生长抑制素-28（M3130-58）、ATP合酶F（0）复合体亚基C1（M7668-64）、朊蛋白质类（M9074-86）聚类效果明显，且呈正相关，与角蛋白质关联蛋白质3-1（M10359-3）呈负相关；埃希氏菌、乳酸杆菌与角蛋白质关联蛋白质8-1（M6658-62）、抗菌肽（M7451-79）及磷载脂蛋白质C-II（M8136-55）聚类效果明显，且呈正相关，与GRF/GHRH 生长激素释放素（M5109-45）、ATP合成蛋白质（M7709-26）、载脂蛋白质E（M34203-3）呈负相关。说明这几种蛋白质与相关微生物相互联系、影响的程度较大。

2.3.2 热力图分析

为对PCA得分散点图进行进一步验证，利用R软件的Pearson算法进行相关性计算[29]，得到的相关性系数（corr）矩阵分析结果和相关性P值矩阵分析结果绘制为热力图，以展示相关性分析结果（图4）。

图4 优势菌-差异蛋白质相关性热力图Fig. 4 Correlation heat map between dominant bacteria and differential proteomics

由图4可知，坏死诱导疫霉蛋白质（M8414-05）、NADH-泛醌氧化还原酶链4L（M10880-9）、生长抑制素-28（M3130-58）、ATP合酶F（0）复合体亚基C1（M7668-64）、朊蛋白质类（M9074-86）与假单胞菌、热死环丝菌呈正相关，且相关性较大，说明这5 种蛋白质的存在有益于假单胞菌和热死环丝菌的生存；角蛋白质关联蛋白质3-1（M10359-3）与假单胞菌、热死环丝菌呈负相关，且相关性较大，说明L40M6199-14抑制这两种菌的生存。

角蛋白质关联蛋白质8-1（M6658-62）、抗菌肽（M7451-79）及磷载脂蛋白质C-II（M8136-55）与埃希氏菌和乳酸杆菌呈正相关，且相关性较大，说明这3 种蛋白质有益于埃希氏菌和乳酸杆菌的生存；GRF/GHRH生长激素释放素（M5109-45）、ATP合成蛋白质（M7709-26）、载脂蛋白质E（M34203-3）与其呈负相关，相关性较大，说明这3 种蛋白质会抑制埃希氏菌和乳酸杆菌的生存；由上述可知，PCA及相关性热力图的结果相似，二者之间可以相互补充及验证。

微生物一般利用体内酶将非蛋白氮类物质降解为氨，氨在酶的催化下同化为氨基酸，氨基酸经过体内的代谢最终合成自身生长需要的菌体蛋白质[30]。而微生物在生长繁殖过程中能够产生一些抑菌和杀菌效果的活性物质，如溶菌酶、ε-聚赖氨酸、苯乳酸、乳酸菌肽[31]。根据上述结论可初步判定：假单胞菌属和热死环丝菌是冷鲜滩羊肉贮藏过程中主要优势腐败菌，且致腐能力强，与之呈正相关的坏死诱导疫霉蛋白质、NADH-泛醌氧化还原酶链4L、生长抑制素-28、ATP合酶F（0）复合体亚基C1、朊蛋白质类促进了假单胞菌和热死环丝菌的增长，与之呈负相关的角蛋白质关联蛋白质3-1抑制了假单胞菌和热死环丝菌的增长；与埃希氏菌和乳酸杆菌呈正相关的角蛋白质关联蛋白质8-1、抗菌肽及磷载脂蛋白质C-II促进了其增长，与之呈负相关GRF/GHRH生长激素释放素、ATP合成蛋白质、载脂蛋白质E会逐渐被优势菌降解，亦降低了它们的增长趋势，抑制了埃希氏菌和乳酸杆菌的生长繁殖。

3 结 论

冷鲜滩羊肉微生物群落演替是从复杂到简单的过程，即进行逆行演替。本研究采用宏基因组技术通过对菌群组成分析，对比了冷鲜滩羊肉贮藏过程中微生物的生长状况，确定了宁夏盐池地区冷鲜滩羊肉的优势菌为假单胞菌、埃希氏菌、热死环丝菌及乳酸杆菌；并指出其中的优势菌群为假单胞菌，其次为热死环丝菌。为探明微生物菌体蛋白质与菌落演替的关联性，采用PCA及热力图分析，结果表明：在贮藏过程中，随着假单胞菌和热死环丝菌渐成为优势菌，坏死诱导疫霉蛋白质（M8414-05）、N A D H-泛醌氧化还原酶链4 L（M 1 0 8 8 0-9）、生长抑制素-28（M3130-58）、ATP合酶F（0）复合体亚基C1（M7668-64）、朊蛋白质类（M9074-86）同时成为菌生长繁殖的主要蛋白质；角蛋白质关联蛋白质3-1（M10359-3）却逐渐被菌所降解。乳酸杆菌和埃希氏菌所占含量百分比的上升，导致角蛋白质关联蛋白质8-1（M6658-62）、抗菌肽（M7451-79）及磷载脂蛋白质C-II（M8136-55）也成为菌生长繁殖的主要蛋白质；GRF/GHRH 生长激素释放素（M5109-45）、ATP合成蛋白质（M7709-26）、载脂蛋白质E（M34203-3） 所占含量比例的下降，说明在菌的生长过程中这几种蛋白质被缓慢降解，或被取代。