犬瘟热病毒CDV-PS株致病力及基因进化分析

施鹏飞，程悦宁，罗国良，王建科，程世鹏，易立

（中国农业科学院特产研究所，长春 130112）

犬瘟热是由副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒属（Morbillivirus）犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）引起的急性、热性、高度接触性传染病，貂、狐、貉、犬、熊猫、虎等动物易感。在圈养的毛皮动物中，犬瘟热病毒的致病性因宿主种类不同也有所差异，对水貂、狐狸和貉的致死率很高，其中貉子的致死率更高[1]，这种差异变化可能由于水貂、狐狸、貉种属差异所致。犬瘟热临床症状以体温呈现双相热、鼻炎、严重的消化道障碍和呼吸道炎症等为特征，少数病例可发生脑炎。目前，对犬瘟热CDV-PS 毒株非犬宿主的致病性研究较少，CDV-PS 株跨物种传播原因还不清楚。因此，为了更好地研究犬瘟热CDV-PS 毒株，本研究将CDV-PS毒株在实验犬上进行了模拟感染试验，成功复制出了犬瘟热症状。对感染试验犬的临床症状、脏器变化、组织病理变化以及病毒体内分布和 H 基因特征进行了详细研究，为更好地预防和控制犬瘟热病提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 CDV-PS 毒株（由中国农业科学院特产研究所特种动物病原与免疫团队保存）。

1.1.2 实验动物 2月龄未经免疫的幼年雄性犬（农村土犬）5 只，体重分别为 4.7、5.3、4.9、5.8、5.5 kg。血清学检测CDV 中和效价为阴性（SN≤4）。通过试纸条和采集粪便分泌物进行PCR 确定实验幼犬无细小病毒、腺病毒和冠状病毒，排除了其他常见病原对本实验的影响。

1.1.3 主要试剂 RNA 提取试剂TriZol（英杰公司）；Ex-Taq酶、AMV反转录酶、pMD18-T载体（大连宝生物公司）；无水乙醇、二甲苯、苏木素和伊红等均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 病毒接种及观察 实验动物分为2 组，3 只犬为对照组（不攻毒），其余2 只为攻毒组，分别皮下接种CDV-PS 4mL。接种病毒前每日早、晚2 次测量体温，并对动物进行观察。接种病毒后，每日测量体温1 次，并对其临床症状进行观察。

1.2.2 病理组织观察 采取死亡犬的肝脏、脾脏、肺脏、膀胱和大脑等组织样品，100mL/L中性福尔马林溶液固定、流水冲洗、乙醇梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片，展片、附贴、烤片、染色。显微镜下观察其病理组织变化。

1.2.3 H 基因克隆和序列 分别取病死犬脏器，依照文献[2]方法对CDV H 基因进行扩增，扩增产物回收纯化后，进行连接，连接产物转化大肠杆菌JM 109 感受态细胞，挑取目的单菌落并提取质粒，测序，序列GenBank登陆号为：HM165273。序列数据的排列、转换、分析比较均利用DNASTAR 软件数据包进行。基于Neighborjoining 法构建种系发生树，采用bootstrap=500 trails 验证。进化树参考毒株的具体信息见表1。

表1 进化树参考毒株信息Table.1 Reference strain information of evolutionary tree

2 结果与分析

2.1 临床症状和剖检结果

接种CDV-PS的2 只试验犬在接种病毒后出现明显的食欲减退；随后出现脚掌增厚；有大量眼睑分泌物；有鼻液流出，开始是浆液性鼻液，后变成脓性鼻液。病初有干咳，后转为湿咳，呼吸困难；发病后期身体发颤，表现为癫痫、转圈、站立姿势异常、步态不稳、共济失调、咀嚼肌及四肢出现阵发性抽搐等其它神经症状。脏器剖检结果表明，肺部有大量的出血斑，肝肿大，肠系膜充血，膀胱壁变厚，脑膜充血、出血，脑腔积液等病变。

2.2 试验犬体温变化

攻毒组2 只试验犬呈现典型的“双相热”。实验犬1 体温2 次增高到40 ℃以上，体温第12 天后逐渐降低，死亡时已降到37 ℃以下，病程19 d；实验犬2 接毒后体温一直保持39 ℃以上，第18 天开始降低，后自愈，体温恢复正常。对照组3 只体温无明显变化。见图1。

2.3 组织病理学变化

病犬的病变主要发生在呼吸系统和神经系统，肺部广泛充血，肺泡腔内充满大量炎细胞，以中性粒为主（图2-A），肺泡与肺泡之间间隔增宽，增宽的组织主要由单核细胞和成纤维细胞构成，局部肺泡呈代偿性扩张，造成肺气肿（图2-B）；脑膜和脑实质充血、水肿，神经细胞肿胀变性（图2-C），可见吞噬细胞吞噬坏死的神经纤维（图2-D）；膀胱毛细血管轻度扩张充血（图2-E）；心肌细胞脂肪变性（图2-F）；脾脏大量淋巴细胞浸润（图2-G）；肝脏偶见有坏死点（图2-H）。

图1 试验犬接种犬瘟热病毒后体温变化情况Fig.1 Changes in body temperature of dogs after vaccination with canine distemper virus

图2 犬主要病理组织学变化Fig.2 The main pathological changes of the dog

2.4 CDV-PSH基因序列的系统进化树分析

基于H 基因核苷酸序列，可将犬瘟热病毒根据地域分类，CDV-PS毒株归类于Asia-1 型，与我国目前主要的流行毒株一致。见图3。

图3 基于犬瘟热病毒Ｈ基因的系统进化树分析Fig.3 Phylogenetic Tree Analysis of H Gene of Canine distemper virus

3 讨论

本研究CDV-PS株在犬传代，出现典型的双相热、肺炎、眼睑分泌物等特征。犬瘟热临床症状呈多样性，有肺炎症状、肠炎症状和脑炎症状[3]。在本次试验中，接种病毒后动物同时出现了上述3 种症状，其中神经症状是在病程后期出现，并导致犬不可逆转的损害。在病理观察中，肺部出现明显的炎性损伤，出现大量淋巴细胞和炎性渗出物，造成肺气肿；脑部神经细胞肿胀变性，出现噬神经现象等[4]，这与广泛报道的犬瘟热病毒主要损伤呼吸系统、消化系统和神经系统的结论一致[5]。

基于犬瘟热病毒H基因的遗传进化分析，可将其区分为亚洲Ⅰ型（Asia-Ⅰ）、亚洲Ⅱ型（Asia-Ⅱ）、欧洲型（Europe）、欧洲野生动物型（Europe wildlife）、美国型（America-2）、北极型（Arctic）和疫苗型（Vaccine或American-1）7 个基因型[6-9]以及新发现的非洲型-Africa[10]。本研究所分离的CDV -PS 归属于亚洲Ⅰ型（Asia-Ⅰ），与目前我国主要流行的犬瘟热基因型一致。犬瘟热病毒在试验犬中的模拟感染研究为下一步开发犬瘟热疫苗和犬瘟热病相关治疗制剂提供感染模型，对更好地控制和预防犬瘟热有着非常积极的作用。