五味子多糖的分离纯化及DPPH自由基清除活性研究

祁玉丽，孙印石，李珊珊

（1.中国农业科学院特产研究所，长春 130112；2.吉林农业大学中药材学院，长春 130118）

五味子为木兰科植物五味子〔Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.〕干燥成熟的果实，在《神农本草经》中被列为上品中药，味酸、性甘温，具有敛肺、滋肾、生津、收汗、涩精之功效[1]。五味子属于多年生藤本植物，可用于生产药品、保健品、饮品及化妆品等[2]。五味子中含有多种化学成分，如挥发性成分、木质素类、有机酸类、糖类等[3]。早期相关研究主要集中在木脂素等脂溶性成分[4]。现代医学研究表明，五味子多糖具有抗疲劳、抗焦虑、抗变态、保护肝损伤、保护肠道及清除自由基等多种生理活性[5-10]，有重要的研究意义和开发利用价值。

多糖提取方法有溶剂提取法、酶解提取法、超声波提取法、微波提取法及超高压提取法等。目前，对于五味子多糖的分离纯化方法各不相同，不同方法得到的多糖级分的活性也不同。本研究采用传统的水提醇沉法获取总多糖[11]，再利用乙醇沉淀分级法，对五味子总多糖进行分级纯化，并分析其单糖组成以及DPPH自由基清除活性，为五味子多糖的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料与试剂

五味子，采收于吉林省集安市，经中国农业科学院特产研究所许世泉研究员鉴定为木兰科植物北五味子〔S.chinensis(Turcz.)Baill.〕的果实；单糖标准品葡萄糖（Glc）、鼠李糖（Rha）、半乳糖（Gal）、半乳糖醛酸（GalA）、阿拉伯糖（Ara）、葡萄糖醛酸（GlcA）、甘露糖（Man）（Sigma-Aldrich 公司）；DPPH（Cat# CD4891-500MG，Coolaber 公司）；1-苯基-3 甲基-5-吡唑酮（PMP）、盐酸-甲醇标准溶液（源叶生物公司）；维生素C（VC）（天津市光复精细化工研究所）；去离子水，由特种经济动植物加工实验室自制；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器

QD8J（BL）单煎机（青岛达尔电子机械销售有限公司）；TGL-16A高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；FD-1A-50 低温冷冻干燥机（北京博医康技术有限公司）；JP-100ST超声波清洗机（深圳市洁盟清洗设备有限公司）；HHS型电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；高效液相色谱仪、LC-16 溶剂输送泵、CTO-16 柱温箱、SPD-M20A 紫外检测器（日本岛津仪器有限公司）；Hypersil ODS2 C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5um）（大连依利特分析仪器有限公司）；721G可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；WP-UP-WF-40 微量分析型超纯水机（四川沃特尔水处理设备有限公司）。

2 方法

2.1 五味子总多糖的提取

选用干燥的北五味子500 g，加入5 L 去离子水，使用单煎机100 ℃提取2 h，4 层纱布过滤，残渣重复提取3 次，合并滤液，使用电磁炉保持微沸状态浓缩滤液至1 L，放至室温，离心（4 500 r/min，10 min），弃去沉淀。向上清液中加入医用酒精，调节乙醇终浓度为80%，沉淀过夜，离心（4 500 r/min，10 min），收集沉淀。向沉淀中加入800 mL 蒸馏水，充分溶解，重复醇沉1次。沉淀用蒸馏水复溶后冷冻干燥，得五味子总多糖（Water-soluble S.chinensis polysaccharides，WSP）。

2.2 五味子多糖的分级纯化

将10 g WSP 充分溶解于150 mL 蒸馏水中，加入医用酒精调节溶液至乙醇终浓度为30%，沉淀过夜，离心（4 500 r/min，10 min），沉淀用少量蒸馏水溶解后冷冻干燥，得到WSP-30。上清液继续加入医用酒精调节溶液至乙醇终浓度为60%，搅拌后静置过夜，离心（4 500 r/min，10 min），所得沉淀用少量蒸馏水复溶后冻干，即为WSP-60。所得上清液用医用酒精调节溶液至乙醇终浓度为80%，重复上述步骤，得到WSP-80。具体流程见图1。

图1 五味子多糖分级纯化流程Fig.1 Flow of fractionation and purification of S.chinensis polysaccharides

2.3 单糖组成分析

称取多糖样品2 mg，加入2 mol/L 盐酸-甲醇溶液0.5mL，充氮气封管，80 ℃水解16 h，氮气吹干后，加入2 mol/L三氟乙酸溶液0.5 mL，120 ℃水解1 h，然后反复加入无水乙醇，去除三氟乙酸，再用PMP 衍生化后用HPLC 检测。采用Shimadzu HPLC 系统，Hypertsil ODS色谱柱，流动相为82.0%PBS水溶液（0.1mol/L，pH7.0）和18.0%乙腈（V/V），流速为1.0 mL/min，进样量为20uL，检测波长为245 nm。

2.4 多糖样品的DPPH自由基清除率检测

2.4.1 试剂的配制 DPPH 溶液的配制：称取5 mg DPPH，加入无水乙醇定容至100 mL，充分溶解，避光保存。

阳性对照（VC）梯度溶液的配制：准确称取0.1000g VC 定容至100 mL，配制成 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 浓度梯度的水溶液。

将不同样品（WSP、WSP-30、WSP-60 和WSP-80）分别配制成 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 浓度梯度的水溶液。

2.4.2 DPPH 自由基清除率的测定 取0.5 mL 样品或VC 水溶液于试管中，加入0.5 mL DPPH 溶液，混匀后避光反应1 h，517 nm 处测吸光值。

DPPH 自由基清除率=[1 －（A样品－A空白）/A对照]×100%，A样品为 0.5 mL 样品或 VC 溶液+0.5 mL DPPH的吸光度；A空白为0.5 mL 样品溶液 +0.5 mL 无水乙醇的吸光度；A对照为0.5 mL DPPH+0.5 mL 蒸馏水的吸光度。

2.5 数据处理

试验数据表示为平均值±标准差。采用IBM SPSS Statistics 19 软件中的单因素方差分析进行组间比较（P＜0.05为差异具有显著性），并使用此软件计算IC50值。使用软件Origin8.5 进行绘图。

3 结果与分析

3.1 五味子多糖的分级纯化以及单糖组成分析

五味子多糖产率为5.2%。通过HPLC 分析单糖组成，结果表明（图2、表1），WSP 主要由GalA 组成（70.3%），其余还有Glc（11.1%）和Gal（7.8%）等；WSP-30 主要是GalA（96.2%）组成；WSP-60 主要由GalA（83.8%）组成，此外还含有少量的Rha（4.0%）、Gal（6.5%）、Glc（3.2%）和Man（2.4%）；WSP-80 主要由GalA（45.7%）和 Glc（26.8%）组成。WSP-30、WSP-60和WSP-80 中均含有丰富的GalA，其中，WSP-30 中GalA 含量更是高达96.2%。GalA 是一种果胶类物质的主要成分，分子量较大，在乙醇中的溶解度小，低浓度乙醇易使其沉淀[12]，GalA 在 WSP-30、WSP-60、WSP-80 中的含量依次降低。

图2 单糖对照品（A）、WSP 样品（B）的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of monosaccharide reference substance(A),WSP(B)

表1 五味子多糖各级分的产率及单糖组成Table 1 Yield of s.polysaccharides fractions and monosaccharide composition （%）

3.2 五味子多糖的DPPH自由基清除率分析

按照“2.4.2”项下方法测定五味子多糖各级分的DPPH 自由基清除率。从图3可以看出，五味子多糖的不同级分均具有一定的DPPH 自由基清除活性，在一定浓度范围，随着多糖浓度升高，活性增强。当多糖浓度均为1.0 mg/mL 时，WSP 对DPPH 自由基清除率可达98.7%。多糖浓度在0.1～0.6 mg/mL 时，WSP-30对DPPH 自由基清除率略高于WSP；浓度继续升高，WSP 活性略优于 WSP-30。WSP-80、WSP-60 对 DPPH自由基的清除活性较WSP、WSP-30 低。

图3 五味子多糖各级分的DPPH 自由基清除活性Fig.3 Scavenging activity of DPPH free radicals of S.chinensis polysaccharides fractions

IC50值也是表示抗氧化能力的一个指标，IC50值越低，抗氧化剂的自由基清除能力越强。WSP-30 的DPPH 自由基清除能力最强，IC50值为0.101 mg/mL；其次为阳性对照Vc、WSP，IC50值分别为0.163 mg/mL、0.173 mg/mL；WSP-80、WSP-60 的 IC50值分别为0.525 mg/mL、1.946 mg/mL。

4 讨论

果胶是多糖的一种，在许多植物中含量丰富，具有多种活性。GalA为果胶的标志性组分，通常认为，GalA含量超过65%的多糖可称为果胶，因此，WSP、WSP-30与WSP-60 均属于不可多得的天然果胶类物质，尤其是WSP-30。许多果胶可作为增稠剂、稳定剂等应用于食品工业中，或作为一种水溶性膳食纤维应用于保健食品和药品中[12]。对WSP 及其子级分的甲酯化度、凝胶特性等进行研究和分析，可以为五味子多糖的应用提供基础，也是课题组下一步工作的重点。

抗氧化活性与许多常见病都有关[13]，如癌症、糖尿病、自身免疫性疾病等。自由基氧化应激反应对许多生物大分子均有损伤作用，最常见的是对蛋白质和DNA 的破坏。DPPH 是常见的具有损伤作用的自由基，其清除率是评价抗氧化作用的重要指标。五味子多糖富含GalA，是一种良好的清除自由基抗氧化剂。本研究中，WSP 对DPPH 自由基清除率能达95%以上，其子级分也具有一定的DPPH 自由基清除活性。对五味子多糖抗氧化作用的研究可以为五味子的进一步开发应用提供数据和理论支持。

综上所述，所分离的五味子多糖及其子级分具有DPPH 自由基清除活性，其中，WSP-30、WSP 的DPPH 自由基清除活性较强，IC50值为0.101 mg/mL、0.173 mg/mL。对五味子多糖抗氧化作用的初步研究为筛选优质多糖与探讨其作用机制及构效关系提供了理论依据。