响应面法优化超高压提取人参花总皂苷工艺研究

韩燕燕，张瑞，姜涛，王英平,3，王恩鹏※，陈长宝※

（1.长春中医药大学，长春 130117；2.吉林农业大学，长春 130118；3.中国农业科学院特产研究所，长春 130112）

人参花为人参的花蕾，总皂苷含量为人参的5 倍以上，挥发油含量高于茎、叶和根，并含有多种矿物质和微量元素，素有“绿色黄金”之称，是珍贵的药材[1-4]。人参花具有降血糖、降血脂、抗疲劳、抗衰老及增强免疫力等多重药理活性[5-9]。近年来，人们加深了对人参皂苷化学结构、生理功能及提取方法等的研究。

目前，人参皂苷的主要提取方法有浸渍、渗漉、蒸煮和回流[10-11]。其中，浸渍和渗漉法存在提取时间长、溶剂耗量大、有效成分提取不完全等缺点。蒸煮法和回流法由于提取温度较高、受热时间长，存在易使对热不稳定的有效成分被破坏、活性下降等缺点[12-13]。因此，在保持药理活性不变的基础上，高效、快速地提取皂苷类等有效成分是人参产业发展中有待解决的问题。

超高压提取是指在常温下将流体静压力（100～1 000 MPa）作用于料液，在设定压力下保持一段时间，使药物细胞内、外有效成分达到溶解平衡，再迅速卸压，使细胞内、外压力差瞬间增大，细胞内有效成分快速地穿过细胞的各种膜，随提取溶剂迅速地转移至细胞外，从而达到提取有效成分的目的[14-16]。超高压对非共价键有影响，对共价键不产生影响，可以使某些蛋白质发生变性、酶失去活力、微生物死亡等，但不会破坏药物中小分子有效成分的化学结构和药理活性，进而达到有效成分提取及灭菌等作用[17]。目前，超高压技术已广泛应用于提取天然产物的有效成分[18]。

响应面中Box-Behnken模块试验设计是效应面设计试验的一种，根据考察因素与考察指标的关系建立数学模型，并进行分析，从中可以判断出模型与试验结果的拟合程度，考察因素间的交互作用对考察指标的影响等[19-24]。本试验基于超高压提取技术，应用响应面法优化超高压提取人参花总皂苷工艺参数，以期为长白山道地药材，尤其以人参为代表的名贵药材及其药用部位的科学开发与应用提供新方法与新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人参花购于抚松县万良市场，经干燥粉碎后过20目筛，备用；人参皂苷Re 对照品（中国药品生物制品鉴定所）；乙醇为分析纯；水为蒸馏水。

1.2 仪器与设备

HPP.L2-700/1 超高压设备（天津华泰森淼生物工程技术股份有限公司）；酶标仪（Infinite M200 PRO，瑞士帝肯公司）。

1.3 方法

1.3.1 人参花总皂苷的提取工艺 人参花→烘干→粉碎过筛（20 目）→加乙醇混匀→超高压提取处理→抽滤→滤液。

1.3.2 供试品溶液的制备 将“1.3.1”项下处理后的滤液置蒸发皿中，60°C 恒温水浴蒸干，加蒸馏水适量溶解，转移至分液漏斗中，加适量乙醚萃取，共3 次，合并水层。再加适量水饱和正丁醇萃取，共3 次，弃去水层。最后用1 倍量蒸馏水萃取，弃去水层。取正丁醇层于蒸发皿中，沸水浴蒸干，适量甲醇溶解，置10 mL量瓶中，定容，摇匀备用。

1.3.3 标准品溶液的制备 精密称取人参皂苷Re 标准品10.0 mg，置10 mL 量瓶中，甲醇定容，摇匀备用。

1.3.4 标准曲线的绘制 取“1.3.3”项下标准品溶液10、20、30、40、60、80、100uL，置具塞型试管中，水浴挥干甲醇（水浴温度＜90°C），依次加入8%香草醛-无水乙醇溶液0.5 mL、72%硫酸溶液5 mL，涡旋60 s，60 ℃恒温水浴反应10 min，立即用冰水冷却10 min，摇匀。平行制备空白对照。采用分光光度法于波长544 nm处测得吸光度（A）；分别以标准品的质量（ug）及吸光度值（A）为横、纵坐标，绘制标准曲线，得到线性方程：y=0.002 6x 0.003 9，R2＝ 0.999 3。

1.3.5 人参花总皂苷含量测定 精密量取供试品溶液50uL，按照“1.3.4”项下方法处理并测定吸光度值（A），带入线性方程中，求出样品浓度，再根据公式计算人参花总皂苷含量：

W ＝C×V/m×1 000，W：人参花总皂苷含量（mg/g）；C：样品溶液总皂苷质量浓度（ug/mL）；V：样品定容体积（mL）；m：原料质量（g）。

1.3.6 单因素试验 乙醇浓度对超高压提取人参花总皂苷含量的影响：称取人参花粉末1.00 g，置真空包装袋中，设置保压时间4 min、料液比1∶60（g∶mL）、提取压力400 MPa，乙醇浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%的条件下放入超高压设备中进行提取。

提取压力对超高压提取人参花总皂苷含量的影响：称取人参花粉末1.00 g，置真空包装袋中，保压4 min、料液比 1∶60（g∶mL）、乙醇 70%，分别在压力为 100、200、300、400、500 MPa 的条件下放入超高压设备中进行提取。

料液比对超高压提取人参花总皂苷含量的影响：称取人参花粉末1.00 g，置真空包装袋中，设置保压时间4 min、乙醇浓度70%、提取压力400 MPa，料液比分别为 1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100（g∶mL）的条件下放入超高压设备中进行提取。

保压时间对超高压提取人参花总皂苷含量的影响：称取人参花粉末1.00 g，置真空包装袋中，设置料液比1∶60（g∶mL）、乙醇70%、提取压力400 MPa，保压时间分别为1、2、3、4、5 min的条件下放入超高压设备中进行提取。

1.3.7 响应面试验 通过单因素试验，确定料液比（A）、乙醇浓度（B）、提取压力（C）和保压时间（D）的最佳优化范围，再利用响应面法进行优化，确定考察变量（X）：A、B、C、D；响应值（Y）：人参花总皂苷含量，进行响应面设计试验分析。因素与水平设计见表1。

表1 因素与水平设计Table 1 Factors and horizontal design

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度的影响 由图1可知，乙醇浓度＜70%时，人参花总皂苷的提取率随乙醇浓度的增加而提高；乙醇浓度＞70%时，皂苷类成分提取率下降，可能是由于不同浓度乙醇水溶液的介电常数与极性不同，导致细胞内蛋白质等大分子成分的溶解能力降低，产生凝聚，使细胞微孔发生堵塞，致使皂苷类成分向外扩散的阻力增大。因此，确定最佳乙醇浓度为60%～80%。

图1 乙醇浓度对总皂苷含量的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the content of total saponins

2.1.2 提取压力的影响 由图2可知，提取压力＜400 MPa时，人参花总皂苷的提取率随提取压力的提高而增加，这是由于组织细胞在高压条件下，细胞内、外存在巨大的压力差，使得细胞结构发生破坏，提高了有效成分的渗透速率及溶剂的扩散动力，从而增加了人参花总皂苷的提取率。但当提取压力＞400 MPa 后，推测由于细胞内外压力差过大，致使细胞中的其他生物大分子溶出，造成溶质通道阻塞，导致人参花总皂苷的提取率下降。由此，确定最佳提取压力为300～500 MPa。

图2 提取压力对总皂苷含量的影响Fig.2 Effect of extraction pressure on the content of total saponins

2.1.3 料液比的影响 由图3可知，当料液比＜1∶60（g∶mL）时，人参花总皂苷的提取率随料液比的增加而增加；当料液比＞1∶60（g∶mL）后，人参花总皂苷的提取率基本保持稳定，这是因为随液料比的增加，细胞内总皂苷的扩散速率不断加快，但当液料比增加到一定值时，细胞内、外总皂苷的扩散速率达到平衡，此时再继续增加液料比，传质动力不再增加，致使人参花总皂苷的提取率不再增加，还会造成提取溶剂浪费。由此，确定最佳料液比为 1∶40～1∶80（g∶mL）。

2.1.4 保压时间的影响 由图4可知，当保压时间＜4 min 时，人参花总皂苷的提取率随保压时间的延长，先缓缓增加后急剧增加；当保压时间＞4 min后，人参花总皂苷的提取率又急剧下降，这可能是因为增加了其他组分流出，从而加大了皂苷类成分的溶出传质阻力，导致人参花总皂苷的提取率下降。由此，确定最佳保压时间为3～5 min。

图3 料液比对总皂苷含量的影响Fig.3 Effect of material-liquid ratio of the content of total saponins

图4 保压时间对总皂苷含量的影响Fig.4 Effect of holding time on the content of total saponins

2.2 响应面试验优化结果

2.2.1 模型建立与显著性分析 根据 Design-Expert 8.0.6 软件中的Box-Behnken 模式设计响应面试验，试验结果见表2。进行多元回归拟合分析，建立回归模型，剔除对人参花总皂苷含量影响不显著的项，得到回归方程：y=3.62+0.12D 0.5AB 0.33AC 0.41BC 0.18A20.56B20.21C20.40D2。对其进行方差分析，结果见表3。由表3可知，回归模型的F 值为13.96，P＜0.000 1（极显著），失拟项P=0.057 7＞0.05（不显著），相关系数R2=0.933 2，校正系数R2Adj=0.886 3，变异系数CV=5.30%，表明模型对该试验的拟合效果较好，可以真实地反映出考察因素对考察指标的影响。综上所述，该模型可用于优化超高压提取人参花总皂苷的工艺参数。

根据表3中的F 值可看出，考察因素对人参花总皂苷提取率的影响由大到小依次为保压时间（D）、乙醇浓度（B）、提取压力（C）、料液比（A）。由表3中的P值可知，模型中D 与A2对人参花总皂苷提取率的影响显著（P＜0.05）；模型中 AB、AC、BC 和 B2、C2、D2对人参花总皂苷提取率的影响极显著（P＜0.01）。

表2 Box-Behnken 试验方案及结果Table 2 Box-behnken test scheme and results

续表2

表3 回归方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

2.2.2 响应面交互作用分析 根据回归方程作相应的3D曲面图及等高线图，列出对人参花总皂苷提取率具有显著性的图（图5），分析交互因素对人参花总皂苷提取率的影响。在其他试验因素保持不变的前提下，曲面的坡度越陡峭，等高线越密集，则表示两因素的交互作用对响应值的影响越大。由图5可知，乙醇浓度与料液比的交互作用对人参花总皂苷提取率的影响极显著，提取压力与料液比和提取压力与乙醇浓度的交互作用对人参花总皂苷提取率的影响显著，与表3的分析结果一致，相互验证。

2.3 最佳工艺参数与模型验证

通过回归模型预测，确定超高压提取人参花总皂苷的最佳工艺参数为乙醇浓度 72.28%、提取压力423.51 MPa、料液比1∶50.50（g∶mL）和保压时间4.22 min，超高压提取人参花总皂苷含量的理论值为3.64%。考虑到试验的实际可操作性，将最佳工艺参数修正为乙醇浓度 72%、提取压力 423 MPa、料液比1∶50（g∶mL）和保压时间4 min。为验证试验结果的可靠性，设定最佳工艺参数，重复3 次试验，以验证试验结果的可靠性，测得超高压提取人参花总皂苷的平均含量为3.657%，与理论预测值相比，相对误差值仅为0.012%。由此证明，该模型是可靠的，具有实际应用价值。

图5 各试验因素A、B、C、D 所构成的三维空间的曲面图及等高线图Fig.5 Surface and contour maps of three-dimensional space composed of test factors A,B,C,D

3 结论

研究结果表明，响应面优化超高压提取人参花总皂苷的最佳工艺参数：乙醇浓度72%、提取压力423 MPa、料液比 1∶50（g∶mL）和保压时间 4 min。在此条件下，测得人参花总皂苷含量为3.657%，与模型预测值相比，相对误差值仅为0.012%，证明该模型是可靠的，具有应用价值。超高压提取可以提供强大的压力，促使溶剂快速地渗透到植物组织细胞内，加快溶剂的渗透及浸润速率，在提高提取效率的同时缩短了提取时间。本操作在常温下进行，可以避免高温对活性成分化学结构发生破坏。超高压提取具有提取时间短、提取效率高、节省溶剂、耗能低、绿色环保、操作简便等优点，可为其他天然产物有效成分的提取提供一种新技术、新工艺。