麝香壮骨膏对诱导型佐剂关节炎的作用机制研究

2019-09-21许艳茹石菊展月李敏唐晓桐王雅俪徐建

特产研究 2019年3期

许艳茹，石菊，展月，李敏，唐晓桐，王雅俪，徐建※

（1.吉林修正药业新药开发有限公司，长春 130012；2.修正药业集团股份有限公司，吉林通化 134000）

麝香壮骨膏药方源于《皇帝内经》，已经有2 000多年的历史[1]。麝香壮骨膏处方由麝香、薄荷脑、冰片等17 味药材组成，功能主治镇痛、消炎，用于风湿痛、关节痛等病症。风湿病关节炎（RA）是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病。大鼠佐剂关节炎模型是一种典型的免疫性炎症模型，是目前最经典、应用最广泛的RA 实验方法[2-3]。本品临床应用广泛，但未见其药效学研究报道。本试验对大鼠足趾皮下注射弗氏完全佐剂来建立大鼠关节炎模型，对小鼠腹腔注射冰醋酸来建立腹膜炎模型，观察麝香壮骨膏对其药效作用。

1 材料

1.1 动物与仪器

ICR 小鼠（雌、雄各半，6～8 周龄，体重 18～22 g）、Wistar 大鼠（雄性，体重 240～260 g）（长春市亿斯实验动物技术有限责任公司）；酶标仪（美谷分子仪器有限公司）；低速离心机（LD5-2A 型，北京医用离心机厂）；电子天平（JA0311N型，上海民桥精密科学仪器有限公司）；弗氏完全佐剂（CFA）（SLBD0736，SIGMA公司）；类风湿因子（RF）、骨保护素（OPG）、核因子（NF-kB）试剂盒（批号20171229）；白介素-17（IL-17）、肿瘤坏死因子（TNF-a）试剂盒（批号：20180115）（南京建成生物工程研究所）。

1.2 药物

麝香壮骨膏（批号：20170905）、阴性基质贴（修正药业集团股份有限公司）；麝香壮骨膏（批号20161105，黄石卫生材料药业有限公司）作为阳性对照药。

1.3 剂量设计

按照中国药典标准，剂量以临床剂量折算获得，根据含膏量及药物与基质的比例计算得出给药面积。

2 方法[4]

2.1 大鼠佐剂关节炎试验

从60 只雄性大鼠中随机取10 只作为空白对照组，其余50 只大鼠进行造模：以75%乙醇消毒后，右后足垫皮内注射CFA0.1 mL/只，制备佐剂性关节炎模型，空白对照组以同样方法注射生理盐水0.1mL/只。造模7 d 开始分组给药，分别为空白对照组、模型对照组（给予基质贴剂）、阳性对照组（64 mg/kg）、麝香壮骨膏低、中、高剂量组（32、64、128 mg/kg），取贴膏剂贴服于大鼠足趾部位，用橡皮膏固定，每天换药1 次，连续给药14 d。

使用游标卡尺分别于造模前、造模后2、5、10、21 d测量大鼠右后足趾肿胀度，参照张钧天[4]方法评估关节炎指数（Arthritis index，AI）。于造模后 2、5、10、21 d 观察并记录全身关节病变程度，标准如下：0 分，无红肿；1 分，小趾关节红肿；2 分，趾关节和足趾肿胀；3 分，踝关节以下的足爪肿胀；4 分，包括踝关节在内的全部足爪肿胀。将各个关节的积分累计起来，即为每只大鼠的AI，最高分为12 分。采用酶联免疫法检测大鼠血清中RF、TNF-a、IL-17、NF-kB 以及OPG 水平。取下右后肢足趾，10%中性甲醛固定，光镜下观察用药前、后大鼠关节腔内滑膜的变化，比较关节组织的病理形态学变化。

2.2 小鼠腹膜炎试验

取小鼠 60 只，雌、雄各半，体重 18～22 g，随机分成空白对照组、模型对照组（给予基质贴剂）、阳性对照组（137 mg/kg）及麝香壮骨膏低、中、高剂量组（46、137、228 mg/kg），每天换药1 次，连续7 d。末次给药后，各鼠均静脉注射0.5%伊文思蓝生理盐水溶液10 mL/kg，并立即腹腔注射0.7%冰醋酸10 mL/kg。注射冰醋酸后15 min 处死小鼠，用生理盐水冲洗腹腔，收集全部冲洗液至5 mL，3 000 r/min 离心 10 min 后，取上清液于630 nm 波长处测定其OD 值，以OD 值表示冲洗液中伊文思蓝的浓度，依据伊文思蓝标准曲线计算伊文思蓝渗出量，间接反映腹膜炎性渗出的程度。

2.3 数据统计与分析

试验数据使用SPSS19.0 统计软件进行统计分析，采用t检验数据显著性分析，结果均以平均值±标准差表示，P＜0.05 表示差异显著。

3 结果与分析

3.1 大鼠佐剂关节炎试验结果

3.1.1 对大鼠足趾肿胀度的影响造模后模型对照组大鼠足趾肿胀度明显增加，与空白对照组相比有极显著差异（P＜0.001），说明模型成功。各给药组在10、21 d 时能够明显抑制足趾肿胀度，与模型对照组有显著差异（P＜0.05），提示麝香壮骨膏能明显抑制肿胀度，减轻佐剂性关节炎大鼠的炎症反应（表1）。

3.1.2 各组大鼠关节炎指数的变化造模2 d 后，除空白对照组外，其余组大鼠表现出不同程度的关节炎症，提示造模成功。随着时间的延长，模型对照组大鼠的关节损伤加重，关节炎指数逐渐上升。用药后各给药组在造模10～21 d 关节炎指数均明显降低，与模型对照组相比有显著差异（P＜0.05），提示麝香壮骨膏能降低关节炎指数，减轻佐剂性关节炎大鼠的炎症反应（表2）。

表1 各组大鼠右后足趾肿胀度的变化Table 1 The swelling degree changes of right hind toe in each group of rats （±s，n=10）

注：###.空白对照组相比，在 0.001 水平上差异极显著（P＜0.001）；*、**、***.与模型对照组相比，在 0.05、0.01、0.001 水平上差异显著或极显著。Note:###.Significant difference with blank control group at 0.001 level(P＜0.001);*,**,***.Significant differences with model control group at 0.05,0.01,0.001 levels respectively.

肿胀度（mm）Swelling degree组别Group剂量（mg/kg）Dose 造模2 d After modeling 2 days造模5 d After modeling 5 days造模10 d After modeling 10 days造模21 d After modeling 21 days空白对照组Blank control group ― 0.05±0.08 0.12±0.15 0.04±0.10 0.11±0.29模型对照组Model control group ― 3.93±0.81### 3.51±0.77### 2.05±0.62### 1.74±0.51###阳性对照组Positive control group 64 3.63±0.76 3.14±0.69 1.54±0.53* 1.26±0.54*低剂量组Low-dose group 32 3.46±0.71 3.06±.73 1.03±0.61** 1.29±0.51中剂量组Medium-dose group 64 3.39±0.97 2.89±0.81 1.18±0.37** 1.07±0.43**高剂量组High-dose group 128 3.44±0.54 3.02±0.64 1.43±0.33* 1.23±0.30*

表2 各组大鼠关节炎指数的变化Table 2 The arthritis index changes of rats in each group （±s，n=10）

注：###.与空白对照组相比，差异极显著（P＜0.001）；*.与模型对照组相比，差异显著（P＜0.05）。Note:###.Significant difference with blank control group at 0.001 level(P＜0.001)；*.Significant difference with model control group(P＜0.05).

组别Dose剂量（mg/kg）Dose造模2 d After modeling 2 days造模5 d After modeling 5 days造模10 d After modeling 10 days造模21 d After modeling 21 days空白对照组Blank control group - 0.0±0.00 0.0±0.00 0.0±0.00 0.0±0.00模型对照组Model control group - 3.8±0.42### 4.7±1.25### 5.9±1.29### 6.1±1.45###阳性对照组Positive control group 64 3.6±0.52 4.7±0.82 4.4±1.17* 4.7±0.67*低剂量组Low-dose group 32 3.5±0.53 4.6±0.97 4.7±1.16* 4.6±0.97*中剂量组Medium-dose group 64 3.7±0.48 4.6±0.70 4.6±1.17* 4.7±1.16*高剂量组High-dose group 128 3.6±0.52 4.5±0.97 4.7±1.16* 4.7±0.95*

3.1.3 麝香壮骨膏对各组大鼠血清生化指标的影响模型对照组大鼠血清OPG 含量明显降低，RF、NF-kB 释放量明显增加，与空白对照组相比有显著差异（P＜0.05）；麝香壮骨膏能明显促进OPG 生成（P＜0.05），低、中剂量麝香壮骨膏抑制血清RF、NF-kB 的表达释放（P＜0.05），提示麝香壮骨膏对关节炎有保护作用，能减轻类风湿的发生。结果见表3。

模型对照组大鼠血清TNF-a和IL-17 含量与空白对照组相比极显著增加（P＜0.01），低、中、高剂量麝香壮骨膏明显抑制大鼠血清TNF-a释放（P＜0.05），低、中剂量麝香壮骨膏对血清IL-17 含量的抑制作用显著（P＜0.05）。结果见表4。

表3 麝香壮骨膏对大鼠血清OPG、NF- B 和RF 水平的影响Table 3 Effects of musk strong bone paste on serum OPG,NF- B and RF levels in rats （±s，n=10）

注：#、###.与空白对照组相比，在 0.05 和 0.001 水平上差异显著；*、**、***.模型对照组相比，在 0.05、0.01 和 0.001 水平上差异显著Note:#,###.Significant difference with blank control group at 0.05 and 0.01 levels;*,**,***.Significant difference with model control group at 0.05,0.01,0.001 levels respectively.

组别 Group 剂量 Dose（mg/kg） OPG（pmol/L） RF（ng/L） NF- B（ng/mL）空白对照组 Blank control group - 332.0±114.9 32.6±2.43 16.4±4.53模型对照组 Model control group - 173.5±45.7### 41.7±12.70## 22.2±5.16#阳性对照组 Positive control group 64 342.1±111.8*** 37.8±9.47* 17.8±6.04*低剂量组 Low-dose group 32 279.0±15.5*** 36.8±16.70* 16.1±4.90*中剂量组 Medium-dose group 64 262.3±116.2* 38.5±6.60* 16.8±6.18*高剂量组 High-dose group 128 283.1±62.8** 39.7±2.95 18.8±4.56

表4 麝香壮骨膏对大鼠血清TNF- 和IL-17 含量的影响Table 4 Effects of musk strong bone paste on serum TNF- and IL-17 contents in rats （±s，n=10）

组别 Group 剂量 Dose（mg/kg） TNF-（ng/L） IL-17（ng/L）空白对照组 Blank control group - 97.8±62.1 44.3±14.2模型对照组 Model control group - 156.8±65.6## 77.8±33.6##阳性对照组 Positive control group 64 124.2±63.4* 57.4±29.9*低剂量组 Low-dose group 32 86.9±53.8*** 47.6±18.2**中剂量组 Medium-dose group 64 115.8±52.3** 59.1±16.6*高剂量组 High-dose group 128 128.8±46.4* 65.2±27.4

3.1.4 关节滑膜软组织的病理形态学变化空白对照组大鼠的踝关节面光滑，关节腔内无渗出物，滑膜层由2～3 层滑膜细胞组成，排列规则，滑膜细胞下层为疏松结缔组织，未见滑膜增生；模型对照组大鼠踝关节滑膜细胞显著增生，排列絮乱，有大量炎性细胞浸润，结缔组织严重充血，血管翳形成，节腔隙变窄，炎性渗出；麝香壮骨膏中剂量组踝关节面光滑，滑膜细胞增生减少，细胞浸润减轻，滑膜下疏松结缔组织中度充血，关节腔未见狭窄；麝香壮骨膏低、高剂量组以及阳性对照组滑膜轻度增生，少量细胞浸润，滑膜下疏松结缔组织中度充血，关节腔轻度狭窄。结果见图1。

3.2 小鼠腹膜炎试验

由表5可知，模型对照组伊文思蓝的炎性渗出量明显增加，麝香壮骨膏低、中、高剂量组小鼠腹腔伊文思蓝的炎性渗出明显减少，与模型对照组相比有显著差异（P＜0.05），表明麝香壮骨膏可以抑制炎性渗出的发生。

图1 各组大鼠关节滑膜软组织的病理形态学变化Fig.1 Pathomorphological changes of synovial soft tissue in each group of rats

表5 麝香壮骨膏对各组小鼠腹腔伊文思蓝渗出量的影响Table 5 Effects of musk strong bone paste on the exudative amount of Evans blue from the abdominal cavity of mice in each group （±s，n=12）

组别 Group 剂量（mg/kg） Dose 伊文思蓝渗出量（ g/mL） Exudative amount of Evans blue空白对照组 Blank control group - 0.163±0.012模型对照组 Model control group - 0.944±0.338###阳性对照组 Positive control group 137 0.660±0.292*低剂量组 Low-dose group 46 0.680±0.192*中剂量组 Medium-dose group 137 0.560±0.102**高剂量组 High-dose group 228 0.672±0.253*

4 讨论

炎症早期主要表现为毛细血管扩张、通透性亢进、渗出和水肿[5-6]，麝香壮骨膏可以抑制小鼠腹腔毛细血管通透性，对炎症有较好的抑制作用。NF-kB 是炎症反应中至关重要的调控器[7-8]；破骨细胞是RA 骨破坏进程中发挥关键作用的细胞，是介导滑膜局部炎症的关键细胞之一[9-11]，近年来研究发现，它也是参与关节破坏的主要效应细胞[12-13]。在骨代谢中，RANK/RANKL/OPG系统涉及成骨细胞和破骨细胞的相互作用[14]，RANKL和OPG由骨祖细胞和成骨细胞合成分泌[15-16]，破骨细胞表面RANK 受体与分泌型RANKL 结合，诱导破骨细胞的分化，在破骨细胞性骨吸收中发挥重要作用。本研究发现，麝香壮骨膏通过抑制血清RF 的表达，有效提高了OPG 的表达水平，OPG与NF-kB 竞争性地结合到破骨细胞前体细胞上，降低与RANKLRANK 结合率，激活破骨细胞核因子-k（NF-kB）信号途径，促进TNF-a和IL-17 的表达和分泌，从而抑制破骨细胞性骨吸收而发挥作用。

麝香壮骨膏临床应用广泛，但其有效的作用机制未见研究报道，对RA 的治疗机制涉及多个方面。本研究主要就该方对大鼠关节损伤的保护作用进行了探讨，对RA 发病环节中其他因素的影响有待进一步研究。随着分子生物学和免疫学研究内容的深入与研究手段的发展，本方剂的抗RA机制会有待进一步探讨。