组织芯片多重免疫组织化学染色方法的优化

许 特，王 筠，邓 芳,，李延鹏，屈军乐，颜鸿飞，盛司潼

1)深圳大学生命与海洋科学学院，广东深圳518055；2)深圳大学物理与光电工程学院，光电子器件与系统教育部/广东省重点实验室，广东深圳518060；3)西安交通大学口腔医院，陕西省颅颌面精准医学重点实验室，陕西西安710004；4)汕头大学医学院附属肿瘤医院，广东汕头 515000

迄今，免疫组织化学 (immunohistochemistry，IHC)技术已广泛用于生物学、基础医学及临床病理学等学科中，依据抗原与抗体特异性免疫反应为基本原理，是原位检测细胞、组织和器官等形态学多种指标的重要技术手段[1]．SHI等[2-4]发明抗原加热修复法，可有效暴露并解链石蜡包埋组织中因甲醛固定所形成的分子交联，使抗原决定簇充分暴露，从而增强抗原与抗体的特异性免疫显色效应．该技术极大地扩展了IHC在组织胚胎发育学与病理学的基础研究，以及分子病理学的临床应用．随着IHC技术方案和使用工具的不断革新和改良，目前已从对单一已知抗原的检测，发展至双重甚至多重抗原的检测[5]，并从对单一组织切片染色，演变到对同一玻片排列的上百张微型石蜡组织切片染色．现有技术手段不仅能够同时观察多种蛋白质的表达水平与分布位置，还可通过共定位分析蛋白质之间可能的互相作用关系，甚至通过追踪疾病发展过程中蛋白质表达的动态变化，挖掘长期归档的、罕见病变的，以及微量组织标本的潜在生物学与病理学信息．但是，现有的多重IHC染色技术在组织芯片上的应用还存在缺陷．例如，经多次重复的抗原修复后，组织切片上阳性信号会出现明显的衰减、丢失，以及组织结构破损或脱片等. 本研究基于常规的IHC技术流程，根据组织芯片特点，改良多重染色技术的关键步骤，包括玻片滤纸夹层工具的研发、抗原修复液的优选，以及用蒸蛋器替代微波炉加热等，可为大通量微型组织切片的高能应用提供新的技术手段和实验依据．

1 材料与方法

1.1 组织标本与抗体

石蜡包埋甲醛固定的人胃癌和肝癌组织散片由汕头大学医学院提供．胃癌组织芯片购自西安艾丽娜公司．抗AKT、cleaved Caspase-3和p53抗体购自美国Cell Signaling Technology公司．抗Estrogen Receptor-α和Erk1+Erk2抗体购自英国Abcam公司．

1.2 抗原修复液

选用常用的柠檬酸钠(pH=6.0)、专用IHC-TekTM、柠康酐(pH=7.5)、Tris-EDTA(pH=9.0)和Tris-HCL (pH=9.0)进行染色效果的比对．

1.3 抗原修复技术的改良

多重免疫组织化学染色法见文献[6-7].本研究提出改良的方法为：

微波加热抗原修复：将组织切片浸入候选的抗原修复液中，用微波炉以2 min间隔加热20 s，重复5次后自然冷却到室温．

专用蒸锅加热抗原修复：将抗原修复液放入实验专用的抗原修复蒸锅中预热15 min，然后将组织切片浸入修复液中蒸汽加热15 min，再自然冷却到室温．

票夹蒸锅加热抗原修复：将排列组织切片的载玻片面朝上覆盖一张空白玻片(即组织切片置于两张载玻片之中)，顺时针略错开些缝隙，用票夹夹住固定，放入已预热的抗原修复液中，蒸汽加热15 min后自然冷却到室温．

滤纸夹层-蒸蛋器加热抗原修复：在组织切片四周覆盖3～5层具有良好通透性和吸水性的厚层滤纸(略高于组织切片厚度)，在上面覆盖一张空白玻片，形成中间镂空的夹层(图1)，然后用票夹固定，放入含抗原修复液的小染色缸中，再置于家用蒸蛋器中100 ℃加热15 min，自然冷却到室温．

图1 “滤纸夹层-蒸蛋器”抗原修复新装置示意图Fig.1 The schematic diagram of “filter paper interlayer-egg steamer” antigen retrieval tool

1.4 多重免疫组织化学染色

采用合适抗体工作浓度，遵照常规IHC染片步骤，但用无毒TO(terpentine oil)透明剂替代二甲苯使组织切片脱蜡，并使用甘油明胶封片，退染前先在50～60 ℃水中去封片，用体积分数为80%的乙醇和抗原修复脱色，显微镜下确认无特异性染色后，再进行下一个染色循环．

1.5 H&E染色

根据经典H&E染色步骤[8]，本研究改良了脱蜡步骤．具体染色步骤为：① TO透明剂使组织切片脱蜡；② 用无水乙醇及体积分数分别为90%、 80%和70%的乙醇梯度水化；③ 磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline， PBS)清洗样本；④ 苏木素染细胞核并水洗；⑤ 用质量分数为1%的盐酸酒精浸泡样本1 s；⑥ 用伊红染细胞浆并水洗；⑦ 依次用体积分数为70%、80%和90%的乙醇至无水乙醇梯度脱水；⑧ TO透明剂透明并甘油明胶封片．

2 结果与分析

2.1 四种不同抗原修复工具的染色效果

IHC染色过程中，不同抗原修复方法对多重免疫组织化学的效应影响大不相同[9-11]．本实验对使用微波炉、实验专用传统蒸锅、票夹-蒸锅、滤纸夹层-蒸蛋器4种抗原修复工具的染色效果进行比较，结果见图2．由图2可见，与传统蒸锅修复相比，微波加热修复在多次染色-脱染-复染过程中对组织切片的损伤较大；在蒸气修复中，传统蒸锅修复和票夹-蒸锅修复在多次染色-脱染-复染过程中的抗原丢失情况较滤纸夹层-蒸蛋器严重；在第7次染色后，采用票夹-蒸锅修复工具染色后的阳性信号强度明显降低；采用滤纸夹层-蒸蛋器修复的组织切片完整性较好，且染色信号无明显衰退．

图2 四种不同的抗原修复法在同样本-同抗体多次免疫组化技术中的效果比较(放大200倍)Fig.2 Comparison of effects of four antigen retrieval tools in multiple IHC

2.2 柠康酐抗原修复液显示较强且稳定的染色效应

在IHC多重染色实验中，不同抗原修复液因其成分和pH值的不同，对同一抗体的染色效果有很大差异，且同一抗原修复液对不同类型的抗体染色效果也不同[12-14]．为寻找通用性高，且经得住多次染色-脱色-再染色，效果稳定的抗原修复液，本研究选择对同一组织切片样本进行多种抗体的IHC染色实验．5种抗原修复液分别为柠檬酸钠(pH=6.0)、IHC-TekTM、柠康酐(pH=7.5)、Tris-EDTA(pH=9.0)和Tris-HCL(pH =9.0)，抗体分别为抗细胞膜、细胞质和细胞核的抗体(AKT、p53、Estrogen Receptor-α、cleaved Caspase-3和 Erk1+Erk2)．图3显示了5种抗原修复液在同样本-不同抗体的免疫组化技术中的实验效果．由图3可见，5种抗体经柠康酐、Tris-EDTA和Tris-HCL这3种抗原修复液处理的染色阳性信号强度都明显高于另外两种修复液．而在同一组织切片中，对同一抗体进行多次IHC染色的实验结果(请扫描论文末页右下角二维码)显示，柠康酐抗原修复液处理的组织切片仍显示较强的阳性信号.

图3 五种抗原修复液在同样本-不同抗体的免疫组化技术中的效果比较(放大200倍)Fig.3 Effects of five antigen retrieval buffers in multiple IHC

2.3 TO透明剂可代替有毒二甲苯的脱蜡透明作用

通过H&E染色和IHC多重染色，比较TO透明剂和二甲苯在组织上的染色效果，结果如图4．由图4可见，对于常规使用的有毒二甲苯和无毒的TO透明剂，两者具有相同效果的脱蜡与透明作用．

图4 TO透明剂和二甲苯对石蜡切片脱蜡透明的效果比较 (放大200倍)Fig.4 Effects of TO or xylene agent in IHC and H&E stainings

3 讨 论

目前中国的基础研究和临床病理研究最常用的抗原修复法是微波炉加热修复和高压锅加热修复．但是，辐射与高压对操作人员均有一定的危险性．另外，这两个工具在对组织微型切片进行多次抗原修复时，其加热水分子的旋涡震荡对组织细胞具有较强的冲击力，可导致组织切片破损、脱落及抗原丢失，令多重染色的次数明显受限．

1)抗原修复装置的优化．设计滤纸夹层-蒸蛋器的抗原修复辅助装置，该装置的优点在于明显缩小了液体在组织切片表面可流动的空间和力度，即减少了水分子在加热时对组织切片的冲击力．实验结果表明，蒸锅修复较微波修复力度缓和，能起到保护组织完整性的作用(图2第1和第2列)；而使用滤纸夹层-蒸蛋器修复，比专用蒸锅和票夹-蒸锅修复的阳性染色信号更明显(图2第3列)，还可减少抗原修复液的用量．

2)抗原修复液的筛选．本研究对多重免疫组织化学法所需的抗原修复液进行了优选. 将国内外较常用的5种抗原修复液对表达在组织细胞不同部位的5种抗体进行了比较分析．实验结果揭示，柠康酐(pH=7.5)缓冲液对多种抗体在组织切片上的多次染色-脱色-复染处理，都取得了最好的染色效果．此结果也验证了前人在石蜡包埋组织散片上的效果[15]．

3)对石蜡切片透明方法的改良．二甲苯作为石蜡组织的脱蜡剂、透明剂和封固剂，在病理界得到了广泛使用．但其挥发性强、毒性大，易对长期接触者造成身体伤害[5]，令接触者出现如头晕、肢体震颤、失眠和免疫力下降等身体中毒症状，危害其中枢神经系统，影响人体造血机能，易导致肿瘤产生，因此已被公认为有毒致癌物质[16-17]．TO透明剂作为替代品，其主要成分为松节油，气味芬香，对人体无害[18]．虽然TO透明剂的无毒特征早已得到实验证实，但多年来许多病理工作者和科研人员并不清楚这两者染色效果的差异，以及对组织芯片微型切片的影响，仍习惯性使用二甲苯．为全面推广TO透明剂的使用，本研究通过H&E染色和IHC染色对这两种脱蜡剂的整体效果进行分析．结果表明，无论是组织切片的脱蜡与透明状态、组织完整性和抗原敏感性，TO透明剂的效果均类似二甲苯．

结 语

本研究主要聚焦于在组织芯片上多重IHC染色技术的改良与优化．研究结果表明：自主设计的滤纸夹层-蒸蛋器的抗原修复辅助装置，既可以保护组织切片的完整性，又能维持抗原检测的敏感性和稳定性．经过多种抗原修复液的比对，推荐将多抗体通用型和多复染稳定型的柠康酐(pH=7.5)缓冲液作为组织芯片多重染色的首选抗原修复液．对于透明剂的选择，我们推荐使用无毒的TO透明剂取替有毒的二甲苯. 本研究为组织芯片的多重染色提供了更加实用、有效、廉价、方便且安全的方法，可提升与扩展组织芯片在病理学中的应用价值．