TRAF6基因对缺氧复氧肝细胞凋亡、Caspase-3、Caspase-9表达及线粒体膜电位的影响

顾 勇， 杨 艳， 孟宏涛， 李 娜

1.武警陕西总队医院消化内科，陕西 西安 710054； 2.空军军医大学第一附属西京消化病医院四科

缺血基础上恢复血流，组织损伤加重，甚至产生不可逆性损伤现象称为缺血性再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，I/RI)[1]。肝I/RI损伤机制复杂，肝缺血再灌注(ischemia reperfusion, I/R)过程中各种机制相互作用，最终可引起肝脏受损，引起肝细胞、肝窦状细胞、胆管上皮细胞发生死亡[2]。研究证实，细胞凋亡是I/R损伤后细胞凋亡的重要方式[3]。因此，抑制I/R引起的肝细胞凋亡，对于I/RI治疗具有重要意义。肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor associated factor，TRAF)是一种重要的接头分子，共有TRAF 1～7七个成员，在多种信号通路中均发挥重要作用[4]。有研究显示，抑制TRAF6表达可明显促进宫颈癌细胞凋亡，上调Caspase-3表达[5]。提示TRAF6可通过调节Caspase家族相关蛋白表达而影响细胞凋亡。抑制TRAF6表达可通过下调NF-κB p65水平，抑制炎症相关细胞因子和炎性介质表达水平，从而减轻内毒素/半乳糖诱导的小鼠急性肝损伤[6]；miR-146A可通过抑制IRAK1和TRAF6表达改善肝I/RI[7]。目前TRAF6对缺氧复氧(H/R)引起的肝细胞凋亡及机制尚不清楚。因此，本研究设计合成TRAF6特异性siRNA，并将其转染人正常肝L02细胞，检测细胞凋亡率变化，并进一步检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9及线粒体膜电位变化。以期为肝损伤的治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器DMEM培养基购自美国Gibco；胎牛血清购自杭州四季青；细胞凋亡试剂盒购自江苏凯基；LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；Rhodamine 123购自美国Sigma；TRAF6、Caspase-3和Caspase-9抗体均购自美国CST；流式细胞仪购自美国BD。

1.2 细胞培养及转染人正常肝L02细胞购自中国科学院上海细胞库。细胞使用质量浓度为100 ml/L胎牛血清的DMEM培养液，在体积分数为5%的CO2、37 ℃恒温培养箱培养。转染前以1×105/孔接种L02细胞于6孔板，预先加含青链霉素双抗及血清的DMEM培养液2 ml，在体积分数为5%的CO2、37 ℃恒温培养箱培养，待细胞为80%～90%生长汇合度时，参照脂质体LipofectamineTM2000试剂盒说明，分别制备设计合成的TRAF6特异性siRNA(si-TRAF6)及无干扰作用的siRNA(NC组)与脂质体复合物，并设置仅加脂质体的为空白组，将复合物加入6孔板相应的孔内，于培养箱内常规孵育5～6 h，更换为含血清的培养液继续培养。

1.3 分组及处理将L02细胞随机分为对照组：不进行转染和H/R处理；H/R组：细胞缺氧12 h，复氧12 h；H/R+NC组：通过脂质体LipofectamineTM2000转染无干扰作用的siRNA后进行H/R处理；H/R+si-TRAF6：通过脂质体LipofectamineTM2000转染TRAF6特异性siRNA后进行H/R处理。

1.4 Western blottingsi-TRAF6转染L02细胞及细胞经H/R处理后，加入适量的预冷裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)，在冰上裂解反应30 min，以12 000 r/min 4 ℃离心5 min，收集上清。通过BCA试剂盒检测上清中蛋白浓度。按照每泳道50 μg上样，经SDS-PAGE，湿转法将凝胶中的蛋白质转至PVDF膜，质量浓度为50 g/L脱脂奶粉封闭膜1 h，加一抗稀释液(TRAF6、Caspase-3和Caspase-9抗体，均为1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，加HRP标记的二抗稀释液(1∶3 000)，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜，将ECL显色液滴加至PVDF膜上，曝光，采集图像，Quantity-One软件分析灰度值。蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值。实验重复3次。

1.5 细胞凋亡检测分组同1.3。不含EDTA的胰酶消化各组细胞，制备成细胞悬液，预冷PBS洗涤细胞，收集(1～5)×105个细胞，加500 μl Binding Buffer悬浮细胞，之后加入5 μl Annexin V-FITC，混匀，再加入5 μl PI，混匀，暗室室温反应10～15 min，上机前再加入300 μl Binding Buffer，通过流式细胞仪检测。具体操作按照试剂盒说明。实验重复3次。

1.6 线粒体膜电位测定取1.5项制备的细胞悬液，PBS冲洗，以2 000 r/min离心5 min，0.5 ml PBS重悬细胞，取Rhodamine 123储备液(-20 ℃下溶于DMSO，浓度1.0 g/L)加入细胞悬液中，并将终浓度调整为10.0 mg/L。37 ℃下染色，30 min后通过流式细胞仪分析。实验重复3次。

2 结果

2.1 si-TRAF6转染L02细胞效果将TRAF6特异性siRNA转染L02细胞后，TRAF6蛋白表达明显低于空白组(P<0.05)，而转染无干扰作用的siRNA对TRAF6表达无影响，说明构建的抑制TRAF6表达的细胞成功(见图1、表1)。

图1 Western blotting检测转染si-TRAF6的L02细胞TRAF6蛋白表达Fig 1 Expression of TRAF6 protein in L02 cells transfected with si-TRAF6 detected by Western blotting

组别TRAF6蛋白相对表达量空白组0.622±0.049NC组0.646±0.053si-TRAF6组0.089±0.010*F值168.055P值0.000

注：与空白组比较，*P<0.05。

2.2 H/R后的L02细胞TRAF6蛋白表达水平H/R可明显上调L02细胞TRAF6蛋白表达，而L02细胞转染si-TRAF6后使用H/R处理，TRAF6蛋白表达明显降低(P<0.05)(见图2、表2)。

图2 Western blotting检测H/R后TRAF6蛋白表达Fig 2 Expression of TRAF6 protein in L02 cells after treatingwith H/R detected by Western blotting

2.3 抑制TRAF6蛋白表达对H/R诱导的L02细胞凋亡及膜电位影响H/R可明显促进L02细胞凋亡，降低细胞膜电位，而抑制TRAF6蛋白表达可减弱H/R对细胞凋亡和膜电位影响(P<0.05)(见图3、表3)。

表2 各组细胞TRAF6的蛋白相对表达量

注：与对照组比较，*P<0.05；与H/R+NC组比较，#P<0.05。

表3 抑制TRAF6蛋白表达对H/R诱导的L02细胞凋亡及膜电位影响Tab 3 Effects of TRAF6 protein inhibition on apoptosis and membrane potential of L02 cells induced by H/R

注：与对照组比较，*P<0.05；与H/R+NC组比较，#P<0.05。

图3 抑制TRAF6蛋白表达对H/R诱导的L02细胞凋亡及膜电位影响Fig 3 Effects of TRAF6 protein inhibition on apoptosis and membrane potential of L02 cells induced by H/R

2.4 抑制TRAF6蛋白表达对H/R诱导的L02细胞Caspase-3和Caspase-9表达影响H/R可明显上调L02细胞Caspase-3和Caspase-9蛋白表达，而抑制TRAF6蛋白表达可减弱H/R对L02细胞Caspase-3和Caspase-9表达上调作用(P<0.05)(见图4、表4)。

图4 Western blotting检测抑制TRAF6蛋白表达对H/R诱导的L02细胞Caspase-3和Caspase-9表达影响Fig 4 Effects of TRAF6 protein inhibition on expressions of Caspase-3 and Caspase-9 in L02 cells induced by H/R detected by Western blotting

组别Caspase-3Caspase-9对照组0.072±0.0080.051±0.006H/R组0.578±0.056*0.253±0.026*H/R+NC组0.553±0.051*0.269±0.028*H/R+si-TRAF6组0.202±0.018#0.109±0.012#F值125.63384.320P值0.0000.000

注：与对照组比较，*P<0.05；与H/R+NC组比较，#P<0.05。

3 讨论

细胞凋亡是细胞的一种程序性死亡过程。在对肝I/RI机制的初步研究表明，肝I/RI可引起肝细胞内抑凋亡基因和促凋亡基因表达改变，从而引起细胞发生凋亡，肝细胞凋亡是肝I/RI中肝细胞死亡的一种方式[8]。I/RI可引起细胞凋亡，其凋亡途径可能与线粒体信号通路及死亡受体信号通路有关[9]。因此，寻找引起肝I/R损伤的原因具有重要意义。TRAF6是一种重要的细胞内多功能信号因子，具有独特的受体结合特异性，可参与细胞增殖、凋亡、胚胎发育及骨骼代谢等过程[10]。有研究显示，TRAF6与多种肿瘤细胞增殖、凋亡等生物学特性密切相关，抑制其表达可降低肿瘤细胞生长[11-12]。目前TRAF6在肝损伤中的研究较少，有研究显示，异甘草酸镁可能通过抑制TRAF6及JNK信号通路，降低由ConA引起的肝脏自噬和凋亡水平，从而改善肝损伤[13]；miR-146可通过抑制IRAK1和TRAF6表达改善肝I/RI[7]。但目前关于TRAF6引起肝损伤的机制尚未明确。

肝细胞凋亡是引起肝脏损伤和肝脏疾病的一个中心环节。细胞凋亡机制主要涉及线粒体诱导的内源性通路、死亡受体介导的外源性凋亡通路、ERS启动的凋亡途径等[14-15]。Caspase蛋白在凋亡起始和信号传导过程中均发挥重要作用，在外源性信号通路中，Caspase-8是由死亡受体激活的，Caspase-8的激活可进一步裂解并激活Caspase-3，此外，Caspase-8还可诱导Bid蛋白裂解，Bid蛋白的裂解可使线粒体释放细胞色素C，进而激活Caspase-3和Caspase-9，而Caspase-3的激活可引起底物PARP裂解活化，引起细胞发生凋亡[16-17]。有研究显示，缺氧等细胞外损伤信号传导到线粒体后，可改变线粒体膜渗透性，使细胞色素C释放入胞质，可相继激活Caspase-9和Caspase-3，从而引起细胞凋亡[18-19]。TRAF6可通过诱导Caspase-8依赖性细胞凋亡和NF-κB活化调节细胞活力[20]；提高线粒体膜电位可减弱肝损伤[21]。本研究旨在探讨TRAF6蛋白对H/R诱导的肝细胞凋亡影响及机制。通过将TRAF6特异性siRNA转染L02细胞，发现细胞中TRAF6蛋白表达明显降低，TRAF6蛋白表达降低可明显减弱由H/R诱导的L02细胞凋亡，且可下调Caspase-3蛋白和Caspase-9蛋白表达，提高线粒体膜电位。提示TRAF6对H/R肝损伤机制可能与调控线粒体途径有关。

综上所述，抑制TRAF6基因表达可降低H/R诱导的L02细胞凋亡，提高线粒体膜电位，下调Caspase-3蛋白和Caspase-9蛋白表达。提示TRAF6可能是一个用于肝损伤治疗的有效分子靶点，但目前TRAF6在肝脏疾病研究中相对较少，还需进一步探讨和研究。