miR-223-3p在乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭患者中的表达及其与预后的关系

周 莉，邱源旺，黄利华，苏婷婷，周学士，毛燕群，陆 雁，汪 铮，阎 岩，王 俊，戴亚萍

无锡市第五人民医院感染病重症医学科，江苏 无锡 214000

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的慢加急性肝衰竭病死率极高，严重危害患者的健康[1]。然而乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭(HBV-related acute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF)的发生和发展机制尚不明确。微小核糖核酸(microRNA，miR)是近年来备受关注的一类分子，研究报道微小核糖核酸223-3p(miR-223-3p)与肝脏恶性肿瘤、肝纤维化、肝损伤的发病密切相关[2-4]，但miR-223-3p是否参与HBV-ACLF的发生及发展知之甚少。本研究旨在探讨miR-223-3p在HBV-ACLF患者血浆中的表达及其与预后的关系，以期寻找新的HBV-ACLF诊断和预后评价的生物标志物。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2014年1月至2017年12月无锡市第五人民医院住院和门诊就诊的HBV-ACLF、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者50例，诊断符合我国2015年更新的《慢性乙型肝炎防治指南》[5]，纳入标准：(1)HBsAg阳性持续6个月以上，HBV DNA≥2 000 IU/ml；(2)血清总胆红素每天上升≥17.1 μmol/L，或大于正常上限10倍；(3)PTA≤40%或INR≥1.5。排除标准：(1)经影像学、Fibrotouch或肝活检诊断为肝硬化的患者；(2)合并药物性肝损伤、酒精性肝病、自身免疫性或胆汁淤积性肝病；(3)孕妇；(4)伴有恶性肿瘤、严重全身性疾病者；(5)近6个月内使用过激素等免疫调节剂的患者；(6)近6个月内使用过干扰素或核苷酸类似物抗病毒治疗的患者。

1.2 检测方法

1.2.1 血浆miR-223-3p检测：采集HBV-ACLF、CHB患者及健康体检者空腹外周血3 ml，分离血浆，-80 ℃冰箱保存备用。以U6为外源性内参，运用PRISM®7500型荧光定量PCR仪(美国，ABI公司)，采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组患者血浆中miR-223-3p的表达水平，has-miR-223-3p的Stem-Loop RT引物(5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGGGGT-3′)和PCR引物(F：5′-GGGGTGTCAGTTTGTCAAA-3′，R：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′)、U6RT引物(5′-AAAATATGGAACGCT-3′)和PCR引物(F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′),均购自上海生工生物工程(上海)股份有限公司，严格按照miRNeasy Mini Kit试剂盒(Qiagen，德国，217004)、miRcute增强型miRNAcDNA第一链合成试剂盒(北京天根生化科技有限公司，KR211)、miRcute 增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(北京天根生化科技有限公司，FP411)说明书进行操作。每个样本检测设置3个平行孔，取均值并根据△Ct计算每个miRNAs的相对表达量，且标准差的差值<0.5，△Ct=Ct miR-223-3p-Ct U6，△△Ct =△Ct 实验组样品-△Ct对照组样品，以公式2-△△Ct计算miR-223-3p的相对表达量。

1.2.2 检测肝功能和肾功能：生化指标、HBV DNA、HBV基因型、凝血功能，包括凝血酶原活动度(prothrombin activity，PTA)、国际标准化比值(international normalized ratio，INR)。HBV DNA及基因型由罗氏Lightcycle基因荧光定量分析仪(瑞士，罗氏公司)检测，HBV DNA试剂盒购自瑞士罗氏公司，检测灵敏度为20拷贝/ml；乙型肝炎病毒标志物(HBV-M)应用1235时间分辨荧光免疫分析仪(芬兰，Perlin Elmer Life Sciences公司)检测；凝血功能(PTA、INR)采用Stago-Evolution血凝仪(法国，Stago公司)及配套试剂检测；肝功能和肾功能生化指标采用日立7600全自动生化分析仪(日本，株式会社日立高新技术公司)及配套试剂检测。

1.3 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差表示，采用方差分析或t检验，组间率的比较采用χ2检验，采用Pearson法进行相关性分析，Cox模型分析HBV-ACLF患者预后的相关影响因素，所有统计分析基于双侧假设检验，以α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基本临床资料选取HBV-ACLF、慢性乙型肝炎(CHB)患者各50例，健康对照者(healthy controls，HC)30名，3组患者年龄、性别比较，差异均无统计学意义(F=0.285、0.979，P均>0.05)，HBV-ACLF组与CHB组间HBV DNA水平、基因分型比较差异均无统计学意义(t=1.585，χ2=0.164，P均>0.05)，HBV-ACLF组丙氨酸转氨酶(alanine transaminase，ALT)水平、总胆红素(total bilirubin，TBil)、终末期肝病模型(model for end-stage liver disease，MELD)评分显著高于CHB组和HC组(t=5.199、17.938、6.578和9.541、19.636、13.383，P均<0.001)，PTA水平显著低于CHB组和HC组(t=-15.146、-53.277，P均<0.001)(见表1)。

表1 不同人群基线特征比较Tab 1 Comparison of baseline characteristics among different populations

注：与HC组比较，*P均<0.001。

2.2 不同人群外周血血浆中miR-223-3p相对表达量比较HBV-ACLF组miR-223-3p表达量显著高于CHB组和HC组，组间比较差异有显著统计学意义(t=11.935、17.053，P均<0.001)，CHB组miR-223-3p表达量高于HC组，差异有统计学意义(t=9.581，P<0.001)(见表1)。

2.3 血浆miR-223-3p相对表达量与ALT、TBil、HBV DNA、PTA、MELD评分的相关性miR-223-3p的表达量与HBV-ACLF患者的ALT、TBil、MELD评分呈正相关(r=0.610、0.808、0.702，P均<0.001)，与PTA水平呈负相关(r=-0.846，P<0.001)，但与HBV DNA水平无相关性(r=0.040，P=0.695)。

2.4 血浆miR-223-3p相对表达量与HBV-ACLF患者预后的相关性将HBV-ACLF患者按照24周预后分为存活组和死亡组，HBV-ACLF死亡组PTA水平显著低于存活组(t=-6.845，P<0.001)，MELD评分高于存活组(t=2.883，P=0.006)，miR-223-3p相对表达量显著高于存活组(t=6.127，P<0.001)(见表2)。

表2 HBV-ACLF存活组与死亡组患者的基线特征比较Tab 2 Comparison of baseline characteristics of HBV-ACLF between survival group and death group

2.5 多因素Cox模型分析将年龄、性别、ALT水平、TBil水平、基线HBV DNA、HBV基因型、PTA、MELD评分进行单因素分析差异有统计学意义的ALT、TBil、PTA、MELD评分、miR-223-3p相对表达量进行多因素Cox模型分析，结果显示，与HBV-ACLF患者死亡相关的影响因素依次为停药时血浆miR-223-3p表达量(P=0.023)、PTA(P=0.044)和MELD评分(P=0.049)(见表3)。

表3 停药后复发的多因素Cox模型分析Tab 3 Multivariate Cox model analysis of recurrence after drug discontinuation

注：模型似然比检验，χ2=36.580，P<0.001。

3 讨论

miRNA是近年来新发现的一类非编码小分子RNA，其表达丰富，作用广泛，胚胎发育、细胞增殖分化均受miRNA的调控，同时miRNA是HBV感染和乙型肝炎进展的重要介质，与血中氨基转移酶(ALT/AST)等指标相比miRNA的变化发生得更早，更具组织特异性和可靠性[6]，因此，作为机体免疫应答的始动者，miRNA在HBV感染发病机制中的作用也日益得到重视。miR-223位于X染色体q12上，其异常表达与肝脏炎症损伤、肝细胞癌密切相关。QI等[7]研究报道，在肝细胞癌患者较健康人血清中miR-223明显高表达，但miR-223在HBV感染患者血清中表达较肝细胞癌和健康人均升高，结果提示miR-223与肝细胞损伤有关。YU等[8]研究miR-223在小鼠缺血再灌注肝脏损伤模型中的作用时，发现miR-223在肝缺血再灌注后表达水平显著增加，而且miR-223表达水平与小鼠缺血再灌注肝损伤的血清标记物(ALT/AST)呈正相关，提示miR-223的异常高表达可能参与缺血再灌注肝损伤的关键过程。SCHUELLER等[9]研究结果显示，在急性和慢性小鼠肝脏损伤模型中，肝脏miR-223表达上调仅限于肝细胞并且与肝损伤程度和肝细胞死亡相关。然而，miR-223在CHB患者与HBV-ACLF患者间的表达差异及miR-223的表达在HBV-ACLF发生中的作用鲜见报道。本研究结果显示，HBV-ACLF患者miR-223-3p表达量不但较健康人群明显升高，且显著高于CHB患者(P均<0.001)，结果提示miR-223-3p水平高表达与HBV-ACLF的发生密切相关。

目前有研究结果显示，不同的miRNA表达在病毒性肝炎的发生中作用不同，有的促进病毒复制，有的抑制其复制，因此，miRNA的表达可能与HBV DNA水平相关。WAIDMANN等[10]研究结果显示，miR-22表达水平与HBV DNA水平密切相关，而且在乙型病毒携带、e抗原阳性慢性乙型肝炎、e抗原阴性慢性乙型肝炎的不同HBV感染阶段及HBV DNA>2 000 IU/ml、HBV DNA<2 000 IU/ml的不同HBV DNA定量水平，其表达水平差异均有统计学意义。HAYES等[11]报道，在慢性乙型肝炎患者血清miR-99a、miR-122和miR-125b表达水平与HBV DNA水平相关。然而，miR-223-3p表达水平与HBV DNA水平的相关性鲜见报道，本研究结果显示，两者并无相关性，可能与我们入组观察的CHB和HBV-ACLF病例HBV DNA水平差异无统计学意义，能否说明HBV-ACLF患者血浆miR-223-3p表达水平升高与病毒复制无相关性仍需进一步研究和验证。

目前，miR-223-3p的表达水平与ACLF患者的预后是否相关并不清楚。本研究结果显示，死亡组患者miR-223-3p相对表达量显著高于存活组，单因素及多因素Cox模型分析结果显示，miR-223-3p的表达水平与HBV-ACLF患者死亡相关。而且miR-223-3p的表达与ALT、TBil、MELD评分呈正相关，与PTA水平呈负相关，提示miR-223-3p水平的高表达与HBV-ACLF的预后密切相关。

综上所述，血浆miRNA-223-3p在HBV-ACLF患者中表达水平升高与HBV-ACLF的发生及预后密切相关，有望成为HBV-ACLF诊断和预后评价的新指标。由于本研究入组病例数相对较少，有待扩大样本量进一步研究。