下调GPC-3转录经Wnt/β-catenin通路对肝细胞癌生长的抑制作用

姚 敏， 沈水杰， 陈 洁， 陈 颖， 王 理， 姚登福

1.南通大学医学院免疫学系，江苏 南通 226001； 2.南通大学附属医院临床医学研究中心

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)仍是我国最常见恶性肿瘤之一[1]。因HCC患者早期无明显症状，早期诊断困难，手术切除和肝移植为主要治疗方法；HCC术后易复发，且对放、化疗不敏感，预后差[2]。尽管索拉非尼为HCC非手术患者提供新的方法，但其作用有限，因此寻找更有效的治疗方法已成为肝癌诊治亟待解决的难题。肝细胞恶性转化过程中涉及染色体畸变、基因突变、表观遗传学改变和多种信号通路调节异常[3-4]。临床研究显示，磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(glypican-3，GPC-3)，在HCC组织中高表达，有助于HCC特异诊断及患者预后分析[5-6]。GPC-3通过糖基磷脂酰肌醇锚定于细胞膜表面，位于Wnt/β-catenin通路上游，在HCC进展过程中与肝细胞恶性转化密切相关，但其调控机制仍有待阐明。本文以特异性miRNA下调HCC细胞GPC-3表达，观察对Wnt/β-catenin通路信号分子的影响，以论证对HCC生长的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 对象

1.1.1 体外研究：人HCC HepG2、Hep3B细胞株购自中科院上海细胞所，设空白对照组(untreated组)、阴性对照组(neg-miRNA组)和干预组(miRNA组)。

1.1.2 体内研究：18只BALB/c裸鼠由南通大学实验动物中心提供，鼠龄4～6周，体质量18～20 g，雌雄各半，随机分为空白对照组(untreated组)、阴性对照组(neg-miRNA组)和干预组(miRNA组)，每组6只，于SPF(specific-pathogen free)条件下饲养。

1.2 方法

1.2.1 GPC-3-miRNA设计与质粒构建：根据GPC3(Gene ID：2719)转录本序列，以Invitrogen miRNA软件设计特异miRNA寡聚DNA(5′-TGCTGTGAATTAGTTCCCTTCTTCGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCGAAGAAG

AACTAATTCA-3′和5′-CCTGTGAATTAGTTCTTCTTCGG

GTCAGTCAGTGGCCAAAACCCGAAGAAGGGAACTAAT

TCAC-3′)及阴性对照DNA(5′-TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCA

CGCAGTACATTT-3′和5′-CCTGAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAG

TACATTTC-3′)(http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)。以双蒸水溶解成100 μmol/L，与互补单链和10×退火缓冲液混匀，于95 ℃ 5 min形成双链DNA并稀释成10 nmol/L溶液；取4 μl，加入pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR 2 μl，5×连接缓冲液4 μl，T4 DNA连接酶1 μl，双蒸水至20 μl，室温30 min。

1.2.2 转化质粒与电泳：100 μl DH5α感受态细菌加50 ng质粒，置冰上35 min，42 ℃水浴90 s后置冰上30 min，加600 μl LB液体培养基(5 g酵母，10 g蛋白胨，10 g氯化钠，900 ml双蒸水溶解后加至1 000 ml)，37 ℃，220 r/min× 1 h，5 000 r/min×3 min，弃上清。吸取菌液涂LB平板(含奇霉素50 μg/ml和不含2种)，37 ℃ 1 h，待无液体流动后倒置过夜，平板上长出单菌落为转化成功。按Omega产品说明书抽提质粒；将质粒纯化柱置于1.5 ml离心管内，加入60 μl洗脱液，静置1 min，10 000×g5 min收集质粒。以1.5%琼脂糖胶TAE缓冲液电泳鉴定，以DNA Ladder作DNA分子量标准，在320 nm观察并摄像。

1.2.3 细胞培养和转染：常规细胞培养，待细胞融合度>80%时消化、传代。弃培养液PBS洗涤加含EDTA胰酶消化，当细胞变圆、胞质回缩及间隙增大时弃胰酶，加完培重悬细胞，传代，计数细胞数，以台盼蓝着色鉴别死/活细胞。细胞活力(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。95%以上时依据说明书行转染，转染前24 h，6孔板每孔种入50×104细胞，使转染时细胞密度达到70%，转染前60 min换新鲜完培。100 μl DMEM中加入2 μg质粒配制成A液，100 μl DMEM中加入6 μl转染试剂配制成B液，将B液中加入A液，滴入6孔板，培养，转染48 h后于倒置荧光显微镜下观察转染效率,取细胞备用。

1.2.4 总RNA抽提及定量：按试剂说明制备细胞总RNA，计算总RNA浓度。预冷离心管内加1 μl总RNA (1 μg/μl)、1 μl随机引物(50 μmol/L Oligo)及1 μl 10 mmol/L dNTP mix，DEPC水定容至10 μl，65 ℃水浴5 min，立即置冰上2 min；依次加入2 μl 10×RT butter、4 μl 25 mmol/L Mg2+、2 μl 0.1 mol/L dTT、1 μl RNaseout (40 U/μl)及1 μl SuperScript Ⅲ RT(200 U/μl)，终体积为20 μl；50 ℃水浴50 min，85 ℃水浴5 min，立即置冰上2 min；加1 μl RNase H，37 ℃ 20 min得GPC-3-cDNA。

1.2.5 PCR引物及FQ-PCR扩增：GPC-3及磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物由Invitrogen公司合成。GPC-3正向引物5′-TACCCAAGCCTGACTCCACA-3′和GPC-3反向引物5′-CATCAGTCCCTGGCAGTAAGAG-3′；GAPDH引物序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′和5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′。以cDNA为模板用SYBR染料法进行FQ-PCR。10 μmol/L引物各0.5 μl，cDNA 1.2 μl，SYBR (50×) 0.5 μl, ddH2O加至25 μl；95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸45 s，循环40次，85 ℃溶解。根据相对定量法计算(n=3)：干扰效率=1-2-△△Ct(△Ct=CtGPC-3-CtGAPDH, △△Ct = △Ct样本-△Ct空白)。

1.2.6 免疫印迹分析：依据说明书抽提细胞总蛋白，以BCA法测定浓度。制备10%SDS聚丙烯酰胺凝胶，50 μg待测蛋白加5×SDS上样缓冲液，沸水5 min后上样，恒压60 V×40 min后110 V×60 min，转膜，漂洗，质量浓度为50 g/L脱脂牛奶封闭。加兔抗人β-catenin(1∶500)或p-GSK3β(1∶500)或Cyclin D1(1∶500)或鼠抗人GPC-3(1∶250)，β-actin抗体(1∶1 000)作为内参，4 ℃过夜，洗涤，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔及羊抗鼠IgG二抗(1∶1 000)37 ℃ 1 h，洗涤后ECL显色并拍照。

1.2.7 CCK-8法分析：细胞瞬时转染48 h后，分别接种于96孔板(n=3)，每组含调零、空白、阴性及干扰孔，分别于规定时间点添加CCK-8试剂10 μl，继续培养4 h，脱色摇床1 min后于酶标仪检测A450值。

1.2.8 克隆形成分析：细胞瞬时转染48 h后，分别接种于6孔板(n=3)，每3 d换液，37 ℃培养14 d；吸弃培养液，PBS洗涤1次，预冷75%乙醇固定15 min，0.1%结晶紫染色10 min，PBS洗涤3次，拍照，Quantity One软件克隆计数。

1.2.9 细胞周期分析：依据试剂说明书操作。转染48 h后，换新鲜完培继续培养24 h，收集(5～10)×105细胞，于70%预冷乙醇-20 ℃固定过夜，预冷PBS洗涤沉淀，加0.5 ml碘化丙啶染色，37 ℃避光温浴30 min，随后4 ℃或冰浴避光存放；用流式细胞仪在488 nm波长处检测红色荧光，数据由Beckman Coulter公司Multicycle软件收集、存储和分析。

1.2.10 裸鼠移植瘤模型：细胞培养、转染及筛选人HCC HepG2细胞以质量浓度为100 g/L胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中贴壁培养，待细胞融合度>80%时传代。细胞密度达到70%时，利用GenjetTM转染试剂将neg-miRNA、GPC-3-miRNA分别转染至阴性组及干预组HepG2细胞中，经杀稻瘟菌素筛选，得稳定转染细胞克隆。收集对数期生长细胞，以2×107/只(0.2 ml/只)接种于裸鼠右肩胛部皮下，形成直径4 mm左右皮下隆起。

1.2.11 肿瘤生长曲线测绘：接种后观察裸鼠生存状况、注射部位有无感染和破溃、肿瘤生长自然消退并记录每组肿瘤长出时间。肿瘤出现后，用游标卡尺测量长、短径，肿瘤体积V(mm3)= 0.5×a×b2(a=长径，b=短径)，并根据体积均数值绘制生长曲线。于接种后35 d用颈椎脱臼法处死裸鼠，大体观察移植瘤的生长状况及周围脏器受累情况。剥离肿瘤生理盐水冲洗、擦干，拍照。浸入4%多聚甲醛固定，备用。

1.2.12 免疫组织化学分析：常规脱蜡，水化，双氧水阻断内源性过氧化物酶，高压加热法修复抗原，动物血清封闭非特异性结合。加GPC-3、β-catenin、p-GSK3β及Cyclin D1抗体，4 ℃过夜，PBS漂洗；滴加生物素标记二抗，孵育10 min，PBS漂洗；加链霉素抗生物素-过氧化酶，孵育10 min，PBS漂洗；加新鲜配制四盐酸二氨基联苯胺溶液，显色，水洗，苏木素复染，无水乙醇脱水透明、封片。Olympus公司BX50光学显微镜观察、摄像；以0.01 mol/L PBS(pH=7.5)替代一抗、二抗作阴性对照。阳性细胞百分数即5个视野阳性细胞平均数：0～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。

2 结果

2.1 HCC细胞miRNA转染效率分析将特异GPC-3-miRNA转染HepG2和Hep3B细胞(见图1)，用于体内、外研究。EmGFP标记GPC-3-miRNA质粒，分别转染HCC HepG2和Hep3B细胞，转染后24 h于倒置荧光显微镜下观察，成功转染细胞呈绿色荧光，随机5个视野细胞计算转染效率，显示HepG2细胞为82%，Hep3B细胞为86%。

注：A、C：普通光；B、D：荧光。放大倍数为100倍。

2.2 干预GPC-3抑制癌细胞增殖转染GPC-3-miRNA干扰质粒48 h后HepG2及Hep3B细胞抑制GPC-3的表达对HCC细胞生长的影响(见图2)。转染24 h、48 h、72 h检测细胞生长情况，与对照组(untreated 组和neg-miRNA组)相比，GPC-3-miRNA转染HepG2和Hep3B细胞后明显抑制HepG2及Hep3B细胞生长，呈时间依赖性。与对照组(untreated组和neg-miRNA组)相比，miRNA组平板克隆能力明显降低[HCC HepG2组(t=24.50，P<0.01)vsHCC Hep3B组(t=11.90，P<0.01)]；与对照组相比，均显示转染miRNA后HCC细胞克隆形成能力明显降低[HepG2细胞(t=8.462，P<0.01)vsHep3B细胞(t=7.311，P<0.05)]。

2.3 干预GPC-3影响癌细胞增殖周期HCC细胞转染GPC-3-miRNA后流式细胞仪分析DNA含量分布见表1，HCC HepG2和Hep3B细胞与对照组(untreated组和neg-miRNA组)相比，干预组G1期细胞明显增多，G2和S期细胞明显减少，HCC增殖周期发生G1期阻滞。

图2 下调GPC-3对HCC细胞生长的影响 A：HepG2细胞；B：Hep3B细胞Fig 2 Effect of GPC-3 reduction on the growth of HCC cells A: HepG2 cells; B: Hep3B cells

表1 特异miRNA干预GPC-3基因影响细胞周期Tab 1 Specific miRNA intervention in GPC-3 gene affected cell cycle %

注：与空白对照组比较，*P<0.01。

2.4 下调GPC-3 显著影响Wnt/β-catenin通路信号分子沉默HepG2及Hep3B细胞GPC-3影响Wnt通路信号表达。GPC-3 miRNA分别转染于HepG2(见图3A～3B)及Hep3B(见图3C～3D)细胞，Western blotting分别检测GPC-3、β-catenin和p-GSK3β表达，以及信号蛋白与β-actin的相对比率，可见在GPC-3过表达的HepG2及Hep3B细胞中，空白对照组和阴性对照组中未见明显改变(P>0.05)，而在干预GPC-3后HCC细胞Wnt通路中关键信号分子β-catenin、p-GSK3β表达水平均明显降低(P<0.01)。

2.5 干预GPC-3经Wnt/β-catenin通路影响裸鼠荷瘤生长沉默GPC-3经Wnt/β-catenin通路对裸鼠荷瘤生长的影响(见图4)。裸鼠皮下肿瘤形成(11.17±0.98)d比阴性对照组(5.5±0.55)d、空白对照组(5.33±0.52)d潜伏期延长，肿瘤形成明显延迟(P<0.01)。GPC-3-miRNA组瘤体积为(65.48±13.66)mm3明显小于对照组(空白对照组和阴性对照组)，空白对照组和阴性对照组分别为(404.83±52.63)mm3、(365.67±14.47)mm3，干预组与对照组(空白对照组和阴性对照组)相比，差异有统计学意义(P<0.01，见图4A)。对照组(空白对照组和阴性对照组)瘤体较大、胞浆丰富、核/浆比大、染色深、有丝分裂多见、细胞丰富，排列紊乱，呈巢状，胞膜多不完整；而干扰组肿瘤分界相对较清，排列呈条索状，板状，偶可见细胞核与浆固缩坏死样改变，胞膜较完整且明显。免疫组化(见图4B)检测miRNA组瘤内GPC-3、β-catenin、p-GSK3β和cyclin D1表达均明显减少，与对照组(空白对照组和阴性对照组)比较,差异有统计学意义[GPC-3(t=6.67，P<0.01)、β-catenin(t=9.61，P<0.01)、p-GSK3β (t=4.81，P<0.01)、cyclin D1(t=5.90，P<0.01)]。

3 讨论

肝癌的有效治疗仍为亟待解决的医学难题。HCC中GPC-3过表达，为肝癌诊断具有特异性[5,7-8]的分子标志物[9-10]，然而GPC-3表达与Wnt/β-catenin通路的关系尚不清楚[5]。本文以miRNA特异性抑制HepG2及Hep3B细胞GPC-3表达，探讨干预GPC-3表达癌细胞生物学行为的影响。miRNA成功转染后，癌细胞GPC-3降低、生长明显受抑，呈时间依赖性；平板克隆形成数减少；干预组G2期和S期细胞减少，癌细胞增殖周期发生G1期阻滞；下调β-catenin和p-GSK3β表达[11-12]，提示位于Wnt/β-catenin通路上游GPC-3，可调控该通路信号分子，在HCC进展中起关键作用。

细胞膜表面GPC-3与Wnt/β-catenin等多条信号通路关系密切[13]，以调节自分泌/旁分泌的经典Wnt/β-catenin信号通路刺激HCC细胞生长，其过表达可使细胞结合Wnt能力增强。HCC组织硫酸酯酶-2(Sulfatase-2，SULF-2)过表达可诱导GPC-3表达，促进GPC-3与成纤维生长因子-2结合刺激细胞生长，提高Wnt3a及稳定β-catenin表达，参与磷脂酰蛋白聚糖-Wnt/生长因子复合物组成[14]；Wnts与GPC-3的硫酸类肝素链(heparan sulfate，HS)结合形成磷脂酰蛋白聚糖-Wnt/生长因子复合物，在SULF-2作用下Wnts从HS上释放，与Frizzled受体结合激活Wnt/Frizzled下游区域的信号传导，使GSK3β磷酸化，p-GSK3β使降解β-catenin的复合物分解，胞质β-catenin聚集并向胞核移动，使核Tcf/Lef转录增强，上调相关靶基因如Cyclin D1，促进HCC细胞增殖[15]，被裸鼠模型证实。

注：1:空白对照组；2.阴性对照组；3.干预组；与空白对照组比较，*P<0.01。

图3 沉默GPC-3影响Wnt/β-catenin通路信号分子A：HepG2细胞GPC-3、β-catenin和p-GSK3β免疫印迹分析；B：对应蛋白与

β-actin的Quantity One (Bio-Rad)灰度值；C：Hep3B细胞GPC-3、β-catenin和p-GSK3β免疫印迹分析；D：对应蛋白与β-actin的Quantity One (Bio-Rad)灰度值

Fig 3 Silence GPC-3 affects Wnt/β-catenin pathway signal moleculesA: analysis of immune imprints of HepG2 cells GPC-3, β-catenin and p-GSK3; B: corresponding protein and β-action Quanticity One (Bio-Rad) gray value; C: analysis of immunoimprinting of Hep3B cells GPC-3, β-catenin and p-GSK3; D: corresponding protein and β-action Quanticity One (Bio-Rad) gray value

注：1、2：空白对照组；3、4：阴性对照组；5、6：干预组。

注：SP,放大倍数为100倍。

沉默GPC-3后HepG2细胞在裸鼠皮下成瘤能力明显降低，干预GPC-3抑制HepG2细胞在裸鼠体内的增殖能力。检测瘤组织Wnt通路关键信号分子p-GSK3β及下游β-catenin和Cyclin D1表达，显示沉默GPC-3后几种信号蛋白表达均减少。与体外研究结果一致[16]。推测GPC-3可能通过磷酸化抑制GSK3β使胞质p-GSK3β升高，p-GSK3β抑制β-catenin降解，β-catenin在胞质蓄积与转录因子LEF-1结合入核，上调下游靶基因Cyclin D1，促进细胞周期进程，刺激HCC细胞增殖[13]。推论干预GPC-3基因转录或抗-GPC-3[17-18]，均可影响Wnt/β-catenin通路关键信号分子表达，展示了GPC-3活化促进肝癌细胞增殖的分子机制。

综上所述，靶向干预GPC-3基因转录经Wnt/β-catenin通路抑制肝癌细胞增殖和HCC生长，提示GPC-3为HCC治疗潜在的有效靶目标。