盐酸小檗碱对白色念珠菌菌态转换的影响研究

易玉玲， 宋 瑱， 雍江堰， 黄筱雪， 李 燕*

(1.成都中医药大学 医学技术学院，四川 成都 611137；2.重庆两江新区第一人民医院 检验科，重庆 401121)

白色念珠菌是一种二相性真菌，从形态上分为酵母相和菌丝相，在血清等菌丝形成诱导因素的作用下，白色念珠菌可发生由酵母相到菌丝相的菌态转换。已有研究证实白色念珠菌的菌态转换其实是白色念珠菌由定殖菌向致病菌转变的一种标志，与白色念珠菌致病性和生物膜形成密切相关[1-2]。研究表明菌丝的形成可以提高白色念珠菌对机体组织的侵袭力与黏附性，而没有菌丝形成能力的白色念珠菌表现出毒性减低、致病力减弱等特点[3]。另一方面，菌丝的形成可以维持成熟生物膜结构的完整性和多层体系，菌丝的缺乏可以导致生物膜形成能力减弱甚至不形成，而生物膜是造成白色念珠菌高感染性以及高耐药性的主要因素[4]。因此，研究如何抑制酵母相和菌丝相的菌态转换对治疗白色念珠菌生物膜感染具有重要作用。本研究选择了道地药材黄连的主要活性成分盐酸小檗碱作为干预药物，探讨其对白色念珠菌酵母相向菌丝相转换的抑制作用及其机制，为临床抗白色念珠菌感染提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 白色念珠菌标准菌株ATCC-10231，购自广东省微生物菌种保藏中心，为氟康唑敏感菌株。

1.1.2 主要药物及试剂 盐酸小檗碱(成都普菲德生物技术有限公司)，RPMI1640培养基(GBICO)，hochest染色试剂(Solarbio)，Trizol Rengent(Invitrogen)，Trans Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix(北京全式金公司)，TransStart Green qPCR Super Mix(北京全式金公司)。

1.1.3 主要仪器与设备 恒温37 ℃孵育箱(DH-500)购自北京中兴伟业仪器有限公司，超净工作台(SW-QJ-2FD)购自Airtech公司，倒置荧光显微镜(DMI8-M)购自德国徕卡公司，荧光定量PCR仪(qtower2.2)购自德国耶拿分析仪器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 白色念珠菌菌丝形成的体外动力学监测 挑取沙氏培养基上培养48 h的白色念珠菌置于无菌生理盐水中，显微镜下用牛鲍氏计数板计数，然后用RPMI1640液体培养基稀释成1×106cfu/mL的菌液，将稀释好的菌液按照3 mL/孔的量加入到含有无菌玻片的6孔板中，37 ℃条件下分别于2、4、6、8 h结束培养。将上述培养结束后的玻片取出，用PBS轻轻漂洗3次，置于新的6孔板中加入配制好的hochest工作液进行染色。室温放置5～10 min后，弃去染色液，用PBS洗涤2～3次，置于倒置荧光显微镜下观察结果[5]。

1.2.2 盐酸小檗碱抑制白色念珠菌生长的MIC测定 参考2017版美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)[6]推荐的微量稀释法并略作改良。将盐酸小檗碱溶于DMSO中，配制成质量浓度为256 μg/mL的原液，无菌滤器过滤除菌备用，用RPMI1640对原液进行倍比稀释，质量浓度为256～0.5 μg/mL，按照1.2.1所述菌液配制方法，配制成4×103cfu/mL的菌液。将配制的药液和菌液分别按照每孔100 μL加至96孔板，使每孔菌液终浓度达到2×103cfu/mL，药物终浓度为128～0.25 μg/mL，37 ℃培养24 h后用XTT试剂测定其细胞含量，酶标仪测定A450，计算抑制率，以抑制80%白色念珠菌生长为MIC值。另设阳性对照：只加菌液与RPMI1640培养基；阴性对照：只加RPMI1640培养基，实验重复3次。

1.2.3 hochest染色法观察盐酸小檗碱作用下菌丝表观形态的变化 实验分为5组，分别为对照组(不加药)、氟康唑组、128 μg/mL盐酸小檗碱组、32 μg/mL盐酸小檗碱组、8 μg/mL盐酸小檗碱组。按照1.2.1中配制方法配制白色念珠菌菌悬液，其浓度为2×106cfu/mL，将稀释好的菌液按照每孔1.5 mL加入到含有无菌玻片的6孔板中，然后按照实验分组的要求向6孔板中加入1.5 mL相应的药液，37 ℃培养4、6 h后用hochest进行染色，染色5～10 min后置于倒置荧光显微镜下观察。

1.2.4 RT-PCR检测盐酸小檗碱对白色念珠菌菌丝形成关键基因的影响 同上述操作方法配制菌液，向6孔板中加入白色念珠菌菌液(1.5 mL/孔)，按照1.2.3的实验分组要求加入相应的药液(1.5 mL/孔)，37 ℃培养24 h。根据Trizol法要求提取各组总RNA，并用微量核酸仪测定样品RNA浓度。随后按照全式金逆转录试剂盒说明书要求将RNA样品逆转录为cDNA。参考文献[7-9]设计并在上海生工生物工程公司合成内参与目的基因引物(见表1)，并按照全式金荧光定量试剂盒说明书用RT-PCR扩增菌丝形成关键基因(EFG1、HWP1、ECE1和ALS1)，RT-PCR反应条件：94 ℃预变性30 s，94 ℃变性5 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，40次；于 60～95 ℃做溶解曲线分析。实验重复3次，取平均值，以act1为内参基因，采用相对定量2-ΔΔct法对RT-PCR数据进行分析。

表1 各基因特异性引物序列

2 结果与分析

2.1 盐酸小檗碱抑制白色念珠菌生长的MIC值

盐酸小檗碱对浮游状态下的白色念珠菌ATCC10231显示出明显的抗菌活性，其MIC值均为32 μg/mL。

2.2 白色念珠菌芽管/菌丝形成动态过程

实验用hochest染色法对培养0～8 h的白色念珠菌进行染色，从而观察芽管/菌丝形成动态过程，结果发现白色念珠菌在培养2 h左右形成大量芽生孢子；4 h左右开始形成较为明显的芽管；随后6 h进一步延伸，此时形成的芽管较4 h长，且出现少量的假菌丝；之后8 h大量假菌丝形成，并交织在一起，结果见图1。

图1 ATCC10231芽管/菌丝形成动态过程Fig.1 The dynamic formation process of germ tubes/hyphal of ATCC10231

2.3 药物干预下ATCC10231菌丝生长情况

盐酸小檗碱作用于 ATCC10231 4 h和6 h后，倒置荧光显微镜下细胞形态情况表明，盐酸小檗碱对ATCC10231的菌态转换具有较强的抑制作用，但仅限于高浓度和中浓度盐酸小檗碱，低浓度无明显抑制作用；与氟康唑组相比较，高浓度盐酸小檗碱抑制效果明显优于氟康唑，而中浓度与低浓度盐酸小檗碱抑制作用不及氟康唑；同时与培养4 h的白色念珠菌相比，培养6 h的白色念珠菌菌丝镜下情况与之类似，但其菌落数相对增加，菌丝相对更成熟。其中，128 μg/mL盐酸小檗碱组和4 μg/mL氟康唑组以酵母相细胞为主，且数量较对照组明显减少；32 μg/mL盐酸小檗碱组以酵母相细胞和菌丝相共同存在，菌丝相对较短，且数量显著减少；8 μg/mL盐酸小檗碱组均以菌丝相细胞为主，数量变化不明显，结果见图2。

图2 各药物干预下白色念珠菌菌丝态微观形态Fig.2 The micromorphology of Candida albicans hypahal under drug intervention A为4 h干预：A1：对照组，A2：4 μg/mL氟康唑组，A3：128 μg/mL盐酸小檗碱组，A4：32 μg/mL盐酸小檗碱组，A5：8 μg/mL盐酸小檗碱组；B为6 h干预：B1：对照组，B2：4 μg/mL氟康唑组，B3：128 μg/m盐酸小檗碱组，B4：32 μg/mL盐酸小檗碱组，B5：8 μg/mL盐酸小檗碱组A：the stage of 4 h, A1: the control group, A2: the fluconazole under 4 μg/mL, A3: the berberberine hydrochloride under 128 μg/mL, A4: the berberberine hydrochloride under 32 μg/mL, A5: the berberberine hydrochloride under 8 μg/mL;B: the stage of 6 h, B1: the control group, B2: the fluconazole under 4 μg/mL, B3: the berberberine hydrochloride under 128 μg/mL, B4: the berberberine hydrochloride under 32 μg/mL, B5: the berberberine hydrochloride under 8 μg/mL

2.4 药物干预后菌丝形成关键基因相对表达情况

RT-PCR结果表明，盐酸小檗碱对ATCC10231菌丝形成关键基因EFG1、HWP1、ECE1、ALS1的表达具有一定抑制作用。在ATCC10231的4 h阶段干预组中，128 μg/mL盐酸小檗碱组与氟康唑组HWP1和ECE1表达降低，32 μg/mL盐酸小檗碱组EFG1和ALS1的表达降低，而低浓度盐酸小檗碱无明显抑制作用，差异有统计学意义(P<0.05)，与氟康唑组相比，128 μg/mL盐酸小檗碱组HWP1表达相对降低，ECE1表达相对增加，但差异无统计学意义(P>0.05)。在ATCC10231的6 h阶段干预组中，与对照组比较，氟康唑组EFG1、HWP1、ECE1和ALS1表达均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；同时128 μg/mL盐酸小檗碱组HWP1、ECE1和ALS1表达降低，32 μg/mL盐酸小檗碱组EFG1、HWP1和ALS1表达降低，而8 μg/mL盐酸小檗碱组对菌丝形成相关基因的表达无明显抑制作用，差异有统计学意义(P<0.05)；而与氟康唑组比较，仅有128 μg/mL盐酸小檗碱组ALS1的表达降低，但差异有统计学意义(P<0.05)，其他组基因表达均相对增加。与4 h阶段干预组各基因表达量相比较，6 h阶段干预组中128 μg/mL盐酸小檗碱组ECE1和ALS1的表达以及32 μg/mL盐酸小檗碱组EFG1和ALS1的表达均相对降低，差异有统计学意义(P<0.05)，128 μg/mL盐酸小檗碱组HWP1的表达相对增加，但差异无统计学意义(P>0.05)。具体结果见图3和表2。

图3 药物干预后白色念珠菌菌丝形成关键基因相对表达情况Fig.3 The relative expression level of key genes of hyhal formation A为4 h干预：A1：对照组，A2：氟康唑组，A3：128 μg/mL盐酸小檗碱组，A4：32 μg/mL盐酸小檗碱组，A5：8 μg/mL盐酸小檗碱组；B为6 h干预：B1：对照组，B2：氟康唑组，B3：128 μg/mL盐酸小檗碱组，B4：32 μg/mL盐酸小檗碱组，B5：8 μg/mL盐酸小檗碱组;结果均以各自对照组表达量为标准“1”进行相对比较，*表示与各自对照组相比，P<0.05A:the stage of 4 h, A1： the control group, A2： the fluconazole under 4 μg/mL, A3： the berberberine hydrochloride under 128 μg/mL, A4： the berberberine hydrochloride under 32 μg/mL, A5： the berberberine hydrochloride under 8 μg/mL；B： the stage of 6 h, B1： the control group, B2： the fluconazole under 4 μg/mL, B3： the berberberine hydrochloride under 128 μg/mL, B4： the berberberine hydrochloride under 32 μg/mL, B5： the berberberine hydrochloride under 8 μg/mL；Getting the results by comparing with the expression level of control group ,and * indicats that compared with the control group, the difference is significant (P<0.05)

3 讨 论

白色念珠菌是一种条件致病菌，是医院获得性感染与社区感染主要病原菌之一。近年来随着抗生素滥用、免疫力低下以及生物材料的广泛应用，白色念珠菌已成为临床重要的病原微生物，其中生物膜的形成是该菌感染率和耐药性不断增强的重要因素，而酵母相与菌丝相的菌态转换对生物膜形成至关重要。研究发现菌丝相细胞是白色念珠菌的主要致病形式，可以增强白色念珠菌对宿主上皮细胞的黏附及侵袭力，有利于躲避宿主免疫系统的攻击[10]。白色念珠菌的菌态转换主要受EFG1调节的cAMP信号途径的调控，外界环境因素作用于转录因子EFG1而发挥作用，进而通过调节菌丝形成特异性基因的表达影响菌丝的生长[11-12]。常见的菌丝特异性基因包括细胞伸长相关蛋白ECE1、菌丝细胞壁蛋白(hyphal wall protein, HWP) 1等，ECE1和HWP1作为菌丝形成特异性基因，在酵母状态下不表达，在菌丝状态下大量表达，其表达受到EFG1转录因子的正向调控。此外，EFG1还可以正向调控细胞黏附相关基因ALS1的表达，ALS1为凝集素样序列基因家族即ALS基因家族所编码，在生物膜形成过程中ALS1高度表达，ALS1基因缺失可致生物膜形成障碍。

盐酸小檗碱作为临床常用中药黄连的主要活性成分之一，具有较强的抗菌作用，已有证据表明盐酸小檗碱在抗白色念珠菌感染方面具有良好的效果。王彩瑞[13]研究了丹皮酚、丁香酚、土槿乙酸以及盐酸小檗碱4种中药对白色念珠菌抑制作用，发现盐酸小檗碱对白色念珠菌具有明显的抑制作用，且抑制效果最强，表明盐酸小檗碱在抗白色念珠菌感染方面具有良好应用前景。此外，也有研究发现盐酸小檗碱对白色念珠菌的抑制作用除了单用具有良好的抗菌效果，与黄芩苷、冰片联用也显现出明显的协同抗菌作用[14]。目前盐酸小檗碱抗白色念珠菌感染的研究主要局限于对浮游菌抑制作用的研究，对白色念珠菌酵母相向菌丝相菌态转换的研究少见报道，其作用机制也不甚明确。因此，我们观察了盐酸小檗碱对白色念珠菌菌态转换表观和关键基因表达的影响，以探讨其抑制作用及其分子调节机制。本研究hochest染色结果发现128 μg/mL和32 μg/mL盐酸小檗碱均能通过抑制白色念珠菌菌丝的形成以及导致其数量减少，从而抑制白色念珠菌发生菌态转换，并且128 μg/mL盐酸小檗碱抑制作用明显优于32 μg/mL盐酸小檗碱和4 μg/mL氟康唑，而8 μg/mL盐酸小檗碱抑制作用不明显，说明盐酸小檗碱对白色念珠菌菌态转换有一定的抑制作用，可以抑制其生长以及菌丝形成，但抑制作用具有一定的剂量依赖性。

表2 药物干预后菌丝形成关键基因表达水平

注：P1表示与各自对照组比较，*表示差异有统计学意义(P<0.05)；P2表示与各自氟康唑组比较；#表示差异有统计学意义(P<0.05)

为了进一步明确盐酸小檗碱对白色念珠菌发生菌态转换的抑制作用机制，分析了菌丝形成关键基因的表达情况。RT-PCR结果表明盐酸小檗碱对ATCC10231菌态转换过程中EFG1、HWP1、ECE1和ALS1的表达具有一定的抑制作用，但仅见于较高浓度的盐酸小檗碱，低浓度盐酸小檗碱无明显抑制作用，并且RT-PCR结果还表明盐酸小檗碱对6 h的菌丝形成关键基因的抑制作用优于4 h，表明盐酸小檗碱的抑制作用存在一定的剂量依赖性和时间依赖性。由此可见，盐酸小檗碱对白色念珠菌的菌态转换具有明显抑制作用，其抑制作用的分子调节机制可能是通过下调菌丝形成关键基因(EFG1、HWP1、ECE1、ALS1)的表达来实现的。同时本课题组还发现盐酸小檗碱可以抑制生物膜形成——生物膜三维结构破环、菌丝形成受抑，其分子机制也与EFG1、HWP1、ECE1和ALS1的表达下调密切相关，因此进一步证实了菌丝形成是生物膜形成的关键一步，利用盐酸小檗碱下调菌丝形成关键基因的表达，影响生物膜形成关键物质——菌丝的形成，可以达到抑制生物膜形成的目的。

目前，临床上针对生物膜感染提出抗生素锁定(ALT)技术进行治疗，采用高浓度的抗生素作用于细菌生物膜，达到有效清除生物膜的目的[15]。而本研究结果表明盐酸小檗碱可以抑制白色念珠菌的菌态转换，但仅限于较高浓度的盐酸小檗碱，同时鉴于白色念珠菌菌态转换在生物膜形成中的重要作用，提示临床可参考ALT技术加大局部药物使用剂量，并延长药物干预时间，影响白色念珠菌菌态的转换，从而控制白色念珠菌感染。