杀松材线虫细菌的分离、鉴定及其培养条件研究

王 方， 王林松， 马 怡， 关腾腾， 张廷婷, 李荣贵

(青岛大学 生命科学学院，山东 青岛 266071)

松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)是一种常见的松树寄生虫，通过松墨天牛等媒介昆虫传播，进而引发松材线虫病，也称松树萎蔫病(Pine wilt disease, PDA)[1]。寄主主要包括黑松、赤松、马尾松等松属植物。被松材线虫感染的松树，针叶呈黄褐色或红褐色，整株干枯死亡[2]。松材线虫病在墨西哥、美国、加拿大、日本、韩国等国均有发生[3-4]。1982年在我国南京市中山陵首次被发现，随后在山东、安徽、广东、浙江等地形成几个疾病中心，并向四周扩散，使这些省的局部地区发生并流行成灾，导致大批松树枯死，给安徽、浙江两省带来的经济损失高达5亿～7亿元[5]。由于松材线虫的毁灭性危害，该虫已被列为对内、对外的重要检疫对象。松萎蔫病的发生与松材线虫及其媒介昆虫都有十分紧密的联系。因此，防治松材线虫对控制松萎蔫病起着非常重要的作用[6]。目前，对松萎蔫病的防治主要采用化学防治法，即采用高效的化学杀虫剂，主要有氨基甲酸酯类(如杀线威、涕天威、克百威等)、有机磷酸酯类(如噻唑磷、灭线磷、克线威等)，线虫容易对这些广谱性合成药物产生抗药性，并且这些杀虫剂多为高毒、剧毒或是高残留的农药，给人类、环境、微生物、水资源等造成严重污染，所以化学杀虫剂的应用受到了很大的限制[7-8]。随着人们环保意识的提高， 从自然界中寻找安全、高效、低毒、环境友好的新型生物杀虫剂已经成为研究热点。微生物是生物资源的重要组成部分，是很多活性物质的天然宝库。关于杀线虫微生物活性产物方面的研究，前人已经做了很多工作。Yu等[9]从青岛近海海域中发现了两株杀线虫活性很强的海洋细菌H-42和S-16，经过测定，24 h内的杀线活性高达100%。这些杀线虫活性挥发物包括dimethyl trisulfide、benzaldehyde、dimethyl disulfide、tert-butylamine；李子等[10]从35株真菌分离到1株具有较高杀线活性的青霉属真菌ML-5，经测定，其杀线活性可以达到86%；陈聪聪等[11]从牡蛎中分离出1株放线菌HT-11，其对线虫的校正死亡率为92%。本研究从青岛大学校园内采集的样品中分离出1株杀线虫活性较高的细菌G8-1，研究了G8-1的最佳培养条件及杀线虫活性物质的热稳定性、pH稳定性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 从青岛大学校内池塘里采集池塘水、淤泥、芦苇根、地衣、青苔、草坪根部土壤、松树根部土壤、洗澡堂墙壁等样品，分别置于无菌容器内，做好标记备用。

1.1.2 线虫来源 供试松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)，分离自青岛大学校内树木中感染松萎蔫病的黑松(Pinusthunbergii)，经无菌化处理后得到无菌线虫。

1.1.3 培养基 ①PDA培养基1 L：去皮马铃薯200 g，切成小块后加蒸馏水煮沸30 min左右，冷却后用4层纱布过滤取上清，再加葡萄糖20 g，琼脂17 g，定容；②NA培养基1 L(液体培养基不加琼脂粉)：蛋白胨5.0 g，牛肉浸膏3.0 g，葡萄糖2.5 g，琼脂17 g，蒸馏水1 L，高温高压灭菌20 min。

1.1.4 主要仪器与设备 SW-CJ-2G 型双人标准超净工作台(苏州净化)，高压蒸汽灭菌锅(日本SANYO)，体视显微镜(麦克奥迪)，2720型PCR仪(Applied Biosystems)，DYY-6B型稳压稳流DNA电泳仪(北京市六一仪器厂)，ZHWY-1 11C恒温培养箱(上海智诚分析仪器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 松材线虫的培养 将灰葡萄孢(Botrytiscinerea)接种在PDA培养基上， 25 ℃培养箱避光培养5～7 d，培养基表面长满白色灰葡萄孢后，接入线虫悬液，25 ℃避光培养1周，待培养瓶壁上爬满线虫后用于实验[12]。

1.2.2 菌株的分离 采用稀释涂布平板法进行菌株的分离。取黄豆粒大小的固体样品加入5 mL无菌水中，25 ℃震荡30 min，制成混悬液，与采集的水样分别稀释10-2、10-3、10-4倍，将不同样品的不同稀释度分别涂布到NA培养基上，30 ℃培养3 d，根据样品及菌落形态的不同选择有代表性的菌株，经过数次平板划线纯化后，将分离出的菌株分别以NA斜面培养基(4 ℃)和甘油菌液形式(-80 ℃)保存。

式中，CM为线虫校正死亡率(%)；d为处理组线虫死亡率(%)；c为对照组线虫死亡率(%)。

1.2.4 16S rRNA序列分析及建立系统发育树 以待测细菌基因组DNA为模板，采用通用引物，进行PCR扩增反应，将扩增得到的16S rRNA 片段与pMD18T 载体连接。连接产物经测序鉴定后，根据NCBI网站的GenBank 数据库进行BLAST分析，选择同源性较高的序列为参照，利用Clustal X 1.83 软件和MEGA 7进行多序列比对分析，构建系统发育树[15-16]。

1.2.5 具有杀线虫活性菌株的发酵条件优化 将12 h菌龄的菌株转接于5 mL NA液体培养基中，30 ℃ 160 r/min振荡培养3 d为起始培养条件。采用单因素分析法，分别测定以下条件：培养基的起始pH (5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、培养温度 (15、20、25、30、35、40 ℃)、接种体菌龄 (9、15、21、27、33 h)和培养时间 (1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 d)对菌株培养液杀线虫活性的影响。结合单因素实验结果，以线虫致死率为考察指标，进行4因素3水平的正交实验。

1.2.6 菌株杀线虫活性物质的稳定性测定 ①热稳定性：将培养上清液转入Eppendorf管，分别置于20、40、60、80、100 ℃的水浴中处理2 h后冷却至20 ℃，测定处理后培养上清液的杀线虫活性，以未接种的NA液体培养基为对照 ，每个处理重复3次。 ②pH稳定性：将培养液上清的pH值用1 mol/L NaOH 和1 mol/L HC1 分别调节至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，常温静置12 h后再分别将pH值中和到pH 7.0，测定杀线虫活性。以未接种的对应 pH 的NA液体培养基为对照，每个处理重复3次。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离和发酵上清液的杀线虫活性测定

从采集的样品中共分离出120株细菌，通过杀线虫活性测定，获得5株校正死亡率大于50%的细菌。其中菌株G8-1发酵上清液的杀线虫活性最高，处理线虫48 h后的校正死亡率为90.81%(表 1)，因此选择该菌株进行下一步实验。

表1 5株细菌培养上清液对松材线虫的杀线活性

注：线虫的校正死亡率为3次重复的平均值±标准差(SD)，P<0.05

2.2 16S rRNA序列及进化分析

以菌株 G8-1基因组为模板，采用通用引物扩增16S rRNA片段，得到大小为1 500 bp左右的序列片段。经测序鉴定后进行BLAST分析，选择同源性较高的菌株，利用邻位相接法构建系统发育树(图1)。结果表明，菌株G8-1与Flectobacillusrhizosphaerae的同源性为99%，在系统发育树同一分支上，因此将G8-1鉴定为FlectobacillusrhizosphaeraeG8-1。

2.3 不同培养条件对菌株G8-1发酵上清液杀线虫活性的影响

2.3.1 不同培养温度发酵上清液对杀线虫活性的影响 由图2可以看出，不同培养温度对杀线虫的活性影响较大，菌株G8-1发酵上清液的杀线虫活性(15～35 ℃范围内)随着温度的升高而升高，高于35 ℃时活性就会降低。因此，菌株G8-1产生活性物质的最适温度为35 ℃，线虫的校正死亡率为92.06%。

2.3.2 不同培养时间发酵上清液对杀线虫活性的影响 由图3可知，菌株G8-1培养时间为3 d时，随着活性物质的不断积累，菌株发酵上清液的杀线虫活性都不断增强。当培养时间超过3 d时，随着培养时间的延长，杀线虫活性逐渐降低。因此，菌株G8-1的最佳培养时间为3 d，线虫的校正死亡率为90.78%。

图1 基于16S rRNA基因序列构建的菌株X30的系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of strain G8-1 based on 16S rRNA gene sequence

图2 不同培养温度对杀线虫的活性影响Fig.2 Effect of different culture temperatures on nematicidal activity

图3 不同培养时间对杀线虫活性的影响Fig.3 Effect of different culture time on nematicidal activityy

2.3.3 不同起始pH发酵上清液对杀线虫活性的影响 由图4可知，当pH值小于7时，菌株G8-1发酵上清液的杀线虫活性随着pH值的增大而提高。当pH值大于7时，随着pH值的升高菌株G8-1发酵上清液的杀线虫活性降低。因此，在pH值为7时，菌株G8-1发酵上清液的杀线虫活性最高，线虫的校正死亡率为91.26%。

2.3.4 不同接种菌龄对杀线虫活性的影响 不同接种菌龄对杀线虫活性测定实验结果表明，接种菌龄为15 h时，菌株G8-1发酵上清液的杀线虫活性最高，校正死亡率为90.33%(图5)。当种子液的培养时间超过15 h时，随着培养时间的增加，菌株发酵上清液的杀线虫活性反而降低。

图4 不同起始pH对杀线虫活性的影响Fig.4 Effect of different initial pH on nematicidal activity

图5 不同接种菌龄对杀线虫活性的影响Fig.5 Effect of different inoculation age on nematicidal activity

2.3.5 菌株 G8-1产杀线虫活性物质发酵条件优化的正交试验 根据正交试验设计原理，结合单因素实验结果，选取培养时间(A)、培养温度(B)、起始pH值(C)和接种菌龄(D)4 个因素，进行4因素3水平正交试验，试验因素水平设计见表 2，正交试验结果及分析见表3。

表2 正交试验因素水平表

根据表3中R值的大小可知，各因素对产杀线虫活性物质影响的主次为 B>A>C>D。其中，培养温度对菌株G8-1产杀线虫活性物质影响最大，其次是培养时间，初始pH和接种菌龄对其影响最小。综合各因素的K值和直观比较，得出最佳工艺条件为A2B2C3D1；根据方差分析结果表明培养温度的影响统计学意义显著，培养时间、起始pH、接种菌龄的统计学意义不显著，因此考虑交互作用。最终确定菌株G8-1的最优发酵条件：培养时间为3 d，培养温度为35 ℃，起始pH 8，接种菌龄为9 h，此时菌株G8-1发酵上清液对线虫的致死率为96.31%(表3)。

表3 正交试验的结果及分析

2.4 杀线虫活性物质的稳定性

2.4.1 杀线虫活性物质热稳定性 不同温度对杀线虫活性物质稳定性的影响见图6，经不同温度处理后，菌珠G8-1发酵上清液的杀线虫活性差异不显著，表明该细菌培养液中杀线虫活性物质具有较好的热稳定性。

2.4.2 杀线虫活性物质pH稳定性 菌株G8-1发酵上清液的杀线虫活性在pH 8.0时稳定性最好。随着酸性或碱性的增强，杀线虫活性有所下降(图7)。

图6 活性物质热稳定性Fig.6 Thermal stability of active substance

图7 活性物质pH稳定性 Fig.7 pH stability of active substance

3 讨 论

松材线虫病是世界上最具危害的松林病害之一，具有适生范围广、寄主种类多、扩散速度快、松树死亡率高、防治困难等特点，因此被称为松树的“癌症”。目前，松材线虫病的控制主要是利用合成杀虫剂喷洒树木、熏蒸受感染的树木，或者将杀线虫剂注射树干控制线虫来实现的[17]。但是，这些用于控制松材线虫的合成杀虫剂都是有毒的化学物质，长期使用不仅会使线虫产生耐药性，而且会导致有毒物质在土壤中积累，造成环境污染[8]。因此许多化学合成农药的应用受到了很大限制。近年来，研究人员已经开始寻找替代和有同等效果的生物防控。

松材线虫的生物防控主要有植物防控和微生物防控两个方面。植物防控是以植物为材料从中提取具有杀线虫活性的成分，目前取得了较大成果，如Guo等[18-19]从无花果叶、无花果根、独活、石榴皮中提取了6种具有明显杀线虫活性的物质；Barbosa等[20]从葡萄中分离出27种植物精油，通过杀线虫活性的测定从中筛选出5种具有较强杀线虫活性的精油。自然界中的微生物种类很多、分布广泛，是很多杀线虫活性物质的重要来源。迄今为止，发现很多具有杀线虫活性的微生物，其中包括真菌、细菌和放线菌等[21-22]。牛秋红等[23]从农田土壤样本中分离出198株细菌，并从中筛选出6株有杀线虫活性的菌株，其中NS-3菌株的杀线虫活性最高，并确定杀线虫活性物质为蛋白类物质；Huang等[24]从92株苏云金芽胞杆菌分离出了苏云金芽胞杆菌BRC-XQ12的杀虫晶体蛋白对松材线虫的毒性最强，并将杀虫晶体蛋白在大肠埃希菌中进行了高效表达，用于松材线虫病的治理。

本研究从青岛大学校园内池塘水、芦苇根、淤泥、青苔、地衣、松树根部土壤、草坪根部土壤、洗澡堂墙壁等样品中分离出细菌120株，通过杀线虫活性的测定，其中从池塘水中分离出的G8-1发酵上清液有很强的杀线虫活性，处理线虫48 h后的校正死亡率为90.81%。经16S rRNA 序列分析，将G8-1鉴定为Flectobacillusrhizosphaerae，这是该菌有杀线虫活性的首次报道。通过单因素分析和正交实验证明了培养时间、培养温度、接种菌龄和起始pH等条件对G8-1产生的活性物质有很大的影响，在培养温度为35 ℃、培养时间为3 d、接种菌龄为9 h、起始pH为8时，菌株G8-1发酵上清液的杀线虫活性可达96.31%。实验结果表明，菌株G8-1易培养、繁殖速度快，并且具有较高的杀线虫活性，在松萎蔫病的防治上有很好的应用前景。在后续实验中将对活性物质的分离鉴定，以及其致病机理做进一步的研究，以期为松材线虫病的生物防控提供参考。