明党参内生菌的分离鉴定及其对金黄色葡萄球菌的抑制作用

叶晓婉，朱润琪，倪新程 ，张桂丽，聂雅阁，戚贺飞 ，谷萌萌，刘珍珍 ，朱大恒*

(1.郑州大学 生命科学学院, 河南 郑州 450000； 2.华中科技大学 同济医学院, 湖北 武汉 430000)

植物内生菌是指生活在健康植物的某个器官或组织内部的微生物，它们在其宿主植物生活史的某个或整个生长阶段中参与共同进化过程[1-5]，这些微生物与宿主植物形成了一种相对稳定的互利共生关系。植物内生菌不仅可以参与药用植物自身化学药物的合成，也可对宿主本身的次级代谢产物进行修饰转化，而且还可通过独立培养，产生丰富多样的次级代谢产物。但就应用微生物的种类而言，还存在大量的可利用菌种有待开发利用，应丰富植物内生菌资源的研究。明党参以根入药，具有润肺化痰、养阴和胃、平肝、解毒之效，并用于治疗肺热咳嗽，呕吐反胃、食少口干、目赤眩晕、疔毒疮疡及具滋补强壮功效[6-8]。新近研究表明，明党参可以降低血清胆固醇及甘油三酯，有控制血小板聚集和抗凝血作用。近年来，由于人为过度采挖及对生境的破坏，明党参的分布区和个体数量日益减少，其种群呈现明显衰退倾向[9-10]。此外，明党参自身的生物学特性如种子产量少、幼苗成活率低、种群自身恢复能力差等原因，也是明党参种群难以扩大而导致濒危的重要原因之一[10-13]。目前国内外对于明党参的研究大多集中于生物学特性、遗传多样性、系统进化、药理药效分析以及外部环境(气候因子、光照、土壤、水分)等方面[5,14-15]，而忽视了明党参植物体内环境的作用，尤其是明党参内生菌种群结构与功能的研究少见报道。明党参内生菌在长时间的协同进化过程中，为了能够在短时间内适应宿主体内微环境，可以使自身的基因信息与宿主基因信息进行交流转移，从而使得某些内生菌能够产生抗生素类物质，特别是某些内生菌具有拮抗致病菌的作用[15-16]。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)在自然界中无处不在，常常引起人类感染， 是人类化脓感染中最常见的革兰阳性病原菌[17-18]。金黄色葡萄球菌能产生肠毒素，对肠道破坏性大，引起急性胃肠炎；能产生溶血毒素，会损伤血小板破坏溶酶体；能杀死白细胞素，破坏人的白细胞和巨噬细胞，引起免疫系统紊乱[17-19]。很多疾病多因使用抗生素引起肠道菌群失调，抗生素敏感菌株受到抑制，耐药的金黄色葡萄球菌株趁机繁殖，对人体造成损伤。本研究对郑州市栽培明党参内生菌进行了分离和拮抗菌株筛选，旨在为抗菌药源成分的开发提供新的来源和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 试验用明党参(ChangiumsmyrnioidesWolff)采自郑州某中草药种植田，供试病原菌菌株金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)为郑州大学微生物学实验室(本实验室)保藏菌株。

1.1.2 培养基 营养琼脂培养基(NA)、营养肉汤培养基(NB)、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA))、放线菌培养基(改良高氏一号)：青岛海博生物技术有限公司。

1.1.3 仪器与设备 HZQ-X100恒温振荡培养箱(太仓市实验设备厂)；GHP-9160隔水式恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)；AvantiJ-25低温高速离心机(美国Beckman coulter公司)；BS223S电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；Eclipse E200生物显微镜(尼康仪器(上海)有限公司)；OLYMPUS BX53正置荧光显微镜(OLYMPUS)；UV-2600紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；SYQ-DSX-280B手提式高压蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；VITEK2 Compact全自动微生物鉴定及药敏系统(bioMérieux生物梅里埃公司)；Autof ms 1000全自动微生物质谱检测系统(安图实验仪器(郑州)有限公司)； 牛津杯(内径( 6.0±0.1 ) mm，外径( 7.8±0.1 ) mm，高( 10.0±0.1 ) mm，青岛海博生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 明党参内生菌的分离 取明党参的组织部位(根、茎、叶)，用自来水冲洗表面泥土和其他杂质，并在干净的自来水中浸泡1 h。移入无菌超净工作台，用无菌水再次冲洗3遍，用无菌滤纸吸干表面的水分。进行“75%乙醇-2.5%次氯酸钠-75%乙醇”的三步表面消毒法(根组织：75%乙醇浸泡3 min，2.5%次氯酸钠7 min，75%乙醇浸泡20 min；茎组织：75%乙醇浸泡3 min，2.5%次氯酸钠5 min，75%乙醇浸泡18 min；叶组织：75%乙醇浸泡2 min，2.5%次氯酸钠3 min，75%乙醇浸泡15 min)，表面消毒过后的植物组织，分别用无菌水冲洗6次，再用无菌滤纸吸干组织表面的水分。用灭菌后的镊子、剪刀、无菌刀片分别将明党参的根与叶组织剪切成0.5 cm×0.5 cm的小块，明党参的茎剪切成长度约为0.5 cm的组织块。在NA、PDA、高氏一号培养基的平板上，分别等距接种4个根、茎、叶组织块，每个处理重复3次。将平板依次放置到37、28、30 ℃培养箱中，观察平板中组织边缘菌落生长状况。

表面消毒效果的检验：对照组实验采用组织印迹法，将经过以上消毒处理的根、茎、叶组织放入NA、PDA、高氏一号培养基内，使灭菌材料表面与培养基接触20 min左右，再移开明党参组织块，将其置于相同条件下培养相同时间，检验平板是否有菌落长出。空白对照实验采用植物最后一次表面消毒的无菌水清洗液作为阴性对照，取90 μL涂布于空白分离培养基上，同实验组相同条件下培养相同的天数，若没有菌落长出，说明植物表面消毒彻底，则实验组分离出来的菌株为内生菌。

1.2.2 明党参内生细菌的纯化与保存 待平板中组织块边缘长出肉眼可见的菌落后，用接种环挑取少许边缘菌落接种到新的NA培养基中，37 ℃恒温箱中倒置培养，待菌落生长后重复此操作6次以上，直到经多次纯化后，得到单一纯菌落。定期观察，选取优势单菌落划线纯化并斜面保存备用。

1.2.3 明党参内生细菌拮抗金黄色葡萄球菌的初筛 采用混菌法进行拮抗致病菌的初筛：在超净工作台中，将NB培养基中过夜培养的金黄色葡萄球菌菌液1.5 mL加入到45 ℃、150 mL的NA培养基中，充分混匀后，取20 mL加入无菌90 mm培养皿中，制成含致病菌平板。距平板中央1.5 cm 处接种6 mm的内生菌菌碟(用打孔器打取培养24 h的明党参内生菌边缘的单菌落菌块)，37 ℃恒温培养，定期观察抑菌状况。

1.2.4 明党参内生细菌拮抗金黄色葡萄球菌的复筛 将初筛有效果的内生菌菌株接种到NB液体培养基中37 ℃、150 r/min培养12 h后，制成种子液。然后在超净工作台中无菌操作，取5 mL的种子液置于95 mL的NB发酵液中37 ℃、150 r/min培养24 h，于4 ℃、12 000 r/min离心10 min，经0.22 μm无菌滤膜过滤获取上清液，上清液抑菌活性检测采用文献[20-21]的牛津杯双层平板扩散法进行，略有改动：在超净工作台中，90 mm无菌培养皿中加10 mL 1.2%的水琼脂，凝固后距平板中心1.5 cm 处分别放置2个牛津杯，再取NB培养基中过夜培养的金黄色葡萄球菌菌液1.5 mL(OD600值为2.481)接种至45 ℃、150 mL的NA培养基中混合均匀后，迅速取20 mL加入至培养皿中，凝固后取出牛津杯，以NB培养基为对照，在牛津杯2个小孔中分别加入100 μL无菌生理盐水(0.85%，CK)和100 μL发酵液上清液，于4 ℃冰箱中静置6 h，37 ℃培养6～12 h后，测量抑菌圈直径(diameter of inhibition zone，DIZ)，试验设置3个平行，结果取平均值。

1.2.5 明党参内生拮抗菌的鉴定 ①形态学鉴定：将明党参内生细菌菌株接种到NA平板上，37 ℃条件下培养1 d，观察其菌落形态并记录；挑取菌落边缘少量菌体用草酸铵结晶紫染液进行单染色，显微镜观察。②Autof ms 1000全自动微生物质谱检测：拮抗病原菌的内生细菌接种到NA平板上，37 ℃培养12 h后，分别取单菌落于1.5 mL 离心管(含300 μL去离子水)中，振荡混匀；再加入900 μL无水乙醇，充分混匀；室温12 000 r/min离心4 min，倒去上清，再次离心，除去上清；40 ℃恒温干燥沉淀2 min；加入10 μL裂解液1(70%甲酸)，振荡混匀，加入同体积的裂解液2(100%乙腈)，充分混匀；室温12 000 r/min离心4 min；吸取1 μL上清液，滴加到样品靶板上，另任意选一靶点滴加1 μL质谱仪校准品，并在室温下晾干；晾干后，取1 μL基质溶液覆盖在上述样品点上，并在室温下晾干，将样品靶板放入质谱仪进行测定。③16S rDNA基因序列同源性分析：明党参内生菌的16S rDNA序列由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。内生菌的基因组DNA提取按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒操作，PCR扩增按照标准实验流程，进行1%琼脂糖电泳，在150 V、100 mA、20 min下观察电泳图，纯化DNA目的条带，用PCR 引物直接测序PCR产物。登陆NCBI网页，对扩增产物结果进行BLAST 比对分析，选取同源性较高的10组16S rDNA序列进行DNA多序列比对，利用MEGA 6.06软件采用邻接法(NJ, Neighbor-Joining)构建系统发育进化树，通过自展法(Bootstrap Method)1 000次检验进行置信度分析。

2 结果与分析

2.1 明党参内生菌的分离与筛选

从新鲜的明党参植株中，经空白对照试验和对照组验证、分离、纯化，确认获得49株内生细菌。实验结果表明：在不同组织中明党参植株获得的菌株数量存在一定的差异，菌株数量根中最多，茎中最少。根据平板中菌落初步特征(菌落大小、菌落颜色、菌落透明度、菌落边缘情况、是否凸起)，初步分为29株。

2.2 内生细菌拮抗金黄色葡萄球菌的初筛

利用混菌法对分离得到的内生细菌进行拮抗金黄色葡萄球菌抑菌活性的筛选，结果显示有4株内生细菌的菌碟周围呈现出抑菌圈，对金黄色葡萄球菌表现出明显的抑菌性，分别为NMY1、NMJ10、NMG10、PMG3。通过初步观察抑菌圈，可以发现菌株NMJ10、PMG3都具有较强的抑菌性，菌株NMG10不仅具有抑菌圈，还可以在致病菌的平板生长良好。

2.3 内生细菌拮抗金黄色葡萄球菌的复筛

采用牛津杯双层平板扩散法，以金黄色葡萄球菌为指示菌株进行初筛有效果的内生菌菌株的复筛，菌液经离心过滤后的上清液在含致病菌的NA培养基中的抑菌效果见图1。由图1可知，明党参内生细菌29株中有至少4株菌对金黄色葡萄球菌有很好的抑制作用,其代谢产物对金黄色葡萄球菌有抑菌活性。试验通过控制致病菌的菌浓度，测定出抑菌圈直径(DIZ),见表1，其中菌株NMJ10的DIZ值为20.30 mm，表明其代谢产物具有相对较强的抑菌作用。

图1 内生菌株对金黄色葡萄球菌的拮抗结果Fig.1 Antagonistic effect of endophytes on Staphylococcus aureus

A:菌株NMJ10代谢产物的抑菌效果;B:菌株PMG3代谢产物的抑菌效果;C:菌株NMY1代谢产物的抑菌效果; D:菌株NMG10代谢产物的抑菌效果

A： Antibacterial effect of metabolites of strain NMJ10;B：Antibacterial effect of metabolites of strain PMG3;C：Antibacterial effect of metabolites of strain NMY1;D：Antibacterial effect of metabolites of strain NMG10

表1 内生菌株对金黄色葡萄球菌的拮抗效果

2.4 复筛菌株的培养及形态特征

把菌株NMY1、NMJ10、NMG10、PMG3接种到NA平板上培养24 h，其平板中菌落形态如图2。菌株NMJ10在NA平板上生长时菌落为圆形、边缘不规则、表面有褶皱、呈现白色、菌落粗糙、不透明、大小为2～3 mm(图2A)，显微镜下观察发现，NMJ10菌体为杆状、两端钝圆、芽胞柱状、孢囊膨大。菌株PMG3在NA平板上生长时菌落为不规则圆、有凸起、呈现白色、菌落湿润、半透明、大小为5～6 mm(图2B)，显微镜下观察发现，PMG3菌体为长杆状、芽胞柱状、两端钝圆、长度较长。菌株NMG10在NA平板上生长时菌落为米白色、不规则、四周呈现扁平根毛状，菌落体积较大(图2C)，显微镜下观察发现，NMG10菌体为芽胞椭圆柱状、偏中生。菌株NMY1在NA平板上生长时菌落为不规则圆，有褶皱，呈现白色，菌落较大、周围半透明，黏稠(图2D)，显微镜下观察发现，PMG3菌体为杆状、芽胞柱状、两端钝圆。

图2 4株菌的菌落特征Fig.2 Colonial characteristics of four strains

A、B、C、D分别为NA平板上菌株NMJ10、PMG3、NMG10、NMY1菌落形态

A, B, C, and D are strains NMJ10, PMG3, NMG10, and NMY1 colony morphology on NA plates, respectively

2.5 拮抗菌株的Autof ms 1000全自动微生物质谱检测

Autof ms1000 基本原理是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS)技术。通过离子的质荷比与离子的飞行时间成正比，检测样品到达检测器的飞行时间即可检测离子，对样品进行分析，通过与数据库信息比对，筛选并确定相应图谱，进而得到鉴定结果，从而实现对不同细菌属、种的鉴定。菌株NMJ10、PMG3、NMG10、NMY1的质谱图谱，如图3所示。由图3可知，菌株NMJ10在5 798.545 m/z附近离子流强度最大，其峰高为2 209，峰面积为5 651 106，信噪比为45，分辨率为745；菌株PMG3在4 307.89 m/z附近离子流强度最大，其峰高为1 600，峰面积为2 789 635，信噪比为28，分辨率为753；菌株NMG10在4 340.531 m/z附近离子流强度最大，其峰高为4 655，峰面积为7 916 964，信噪比为94，分辨率为588；菌株NMY1在2 785.65 m/z附近离子流强度最大，其峰高为5 321，峰面积为6 130 754，信噪比为113，分辨率为474。

菌株NMJ10经检索后与数据库中枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)的匹配分值为8.712，菌株NMG10经检索后与数据库中蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)的匹配分值为8.426，菌株PMG3经检索后与数据库中枯草芽胞杆菌的匹配分值为9.115，菌株NMY1经检索后与数据库中枯草芽胞杆菌的匹配分值为9.179；Autofms1000鉴定结果得分在[6.0,9.0)中为属水平参考，在[9.0,9.5)中为属水平可信种水平参考，因此通过质谱检测可将菌株NMJ10、NMG10、PMG3、NMY1鉴定为芽胞杆菌属。

2.6 内生拮抗菌株16S rDNA基因序列同源性分析及系统发育树分析

经过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、纯化回收DNA目的条带、PCR引物测序，菌株NMJ10的16S rDNA基因序列全长为1 423 bp，菌株PMG3的16S rDNA基因序列全长为1 418 bp，菌株NMG10的16S rDNA基因序列全长为1 417 bp，菌株NMY1的16S rDNA基因序列全长为1 431 bp，通过BLAST同源性比对，结果表明，菌株与芽胞杆菌菌株具有高度同源性。选取与内生菌拮抗菌株同源性较高的10株菌株的16S rDNA基因序列构建系统发育进化树，结果见图4。由图4可知，菌株NMJ10与枯草芽胞杆菌(B.subtilis)、嗜热脂肪芽胞杆菌(B.stearothermophilus)、解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)不处于一个分支，与Bacillussp. KT107处于一个分支，进化距离较近；菌株NMY1与枯草芽胞杆菌(B.subtilis)进化距离较近；菌株PMG3与Bacteriumwsb-1和Bacillustequilensisstrain Y11进化距离较近；菌株NMG10与多株假蕈状芽胞杆菌(B.pseudomycoides)处于一个分支，进化距离较近。结合菌株形态特征、生化特性、Autof ms 1000鉴定结果，初步鉴定菌株NMJ10为芽胞杆菌属菌株(Bacillusspp.NMJ10)，菌株NMY1为枯草芽胞杆菌(B.subtilis)，菌株PMG3为芽胞杆菌属菌株(Bacillusspp. PMG3)，菌株NMG10为假蕈状芽胞杆菌(B.pseudomycoides)。

图3 菌株的Autof ms 1000全自动微生物质谱图

图4 菌株基于16S rDNA序列的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of the strains

3 讨 论

采用三步消毒法和平板培养法从郑州市栽培明党参健康植株的根、茎、叶中成功分离出内生细菌，反复实验操作确认消毒效果，空白对照均未发现有任何菌株生长，终确保分离得到的29株菌株为内生细菌。经过培养特征、形态学鉴定、生化特性、16S rDNA基因序列分析、遗传图谱分析和全自动微生物质谱检测等手段，发现多为芽胞杆菌属，说明芽胞杆菌属优势菌株。从明党参分离筛选的内生细菌中，通过菌株初筛和发酵液复筛，有4株菌对金黄色葡萄球菌产生抑菌活性，其中菌株NMY1为枯草芽胞杆菌(B.subtilis)，其作为重要的生防菌，有着极其广泛的应用价值；菌株NMG10为假蕈状芽胞杆菌(B.pseudomycoides)，其代谢产物可作为生物表面活性剂，近几年也有关于假蕈状芽胞杆菌产纤溶酶的报导，它可作为一种新的微生物资源加以利用；另外菌株NMJ10(Bacillusspp. NMJ10)和菌株PMG3(Bacillusspp. PMG3)为芽胞杆菌属菌株，菌株NMJ10对金黄色葡萄球菌具有较强的抗菌作用，有关该菌株对金黄色葡萄球菌的抑菌机理、有效成分鉴定及其代谢特性等有待进一步研究，同时明党参内生菌菌株种类丰富，有很多有待开发利用的微生物资源。