HPLC-ICP-MS测定双孢蘑菇珍华片原料中的6种砷形态

于 娟，陈啟兰，陈 珏

（漳州片仔癀药业股份有限公司，福建 漳州 363000）

双孢蘑菇珍华片是由漳州片仔癀药业股份有限公司开发的保健食品，具有增强免疫力、保护化学性肝损伤的作用。其原料双孢蘑菇［1-2］是目前世界上栽培最广泛、产量最多的一种食用菌，富含蛋白质、多糖、维生素等，营养丰富，具有较高的医疗保健价值，能够提高机体免疫功能，调节血液中葡萄糖和胆固醇的平衡，具有抗肿瘤、抗氧化、镇痛消炎、抑菌、保肝等作用。但有研究发现：食用菌除维持自身生长发育所必需的元素外，对部分重金属如砷等也具有富集作用。郑伟华等［3］测定了多种食用菌中的砷，检出率为100%。砷经食用菌富集后，通过食物链进入人体，对人体健康构成较大威胁。砷作为公认的有毒物质，作用于机体可引起急、慢性中毒，还具有致癌性、生殖毒性、发育毒性，其含量向来是各国法规标准的关注重点。目前国内标准以砷总量控制为主，但是仅以总砷含量评价砷摄入风险是不够科学的。研究表明：不同的砷形态具有不同的理化性质，特别是其毒性取决于其存在的化学形态。无机砷剧毒，随化合价的不同毒性不同，而砷的有机化合物毒性通常比无机砷小。6种主要砷形态化合物亚砷酸［三价砷As（Ⅲ）］、砷酸［五价砷As（Ⅴ）］、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）、砷胆碱（AsC）和砷甜菜碱（AsB）对实验小鼠的半数致死量（LD50）依次为 14、20、200～1 800、200～2 600、＞6 500、＞10 000 mg／kg［4］，由此可见，不同砷形态之间毒性差异很大，要准确评估食用菌中砷摄入风险，应 进 行 砷 形 态 分 析［5-6］。

本研究以双孢蘑菇鲜品和双孢蘑菇提取物为研究对象，建立高效液相色谱－电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS）测定 6种不同形态砷［As（Ⅲ）、As（V）、MMA、DMA、AsC、AsB］的方法，优化并确定样品前处理方法，进行方法学考察。双孢蘑菇鲜品及其提取物中砷形态化合物分析方法的建立，有助于掌握双孢蘑菇中砷形态分布规律，对于双孢蘑菇及其制品的质量安全性评估和砷化合物人工控制具有重要意义。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪、Agilent 7700型电感耦合等离子体质谱仪（安捷伦科技有限公司）；CR21N型高速离心机（日本日立公司）；XS204电子天平、S40酸度计（梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；IKA MS3涡旋混合器（艾卡仪器设备有限公司）；Multiwave 3000微波消解系统（安东帕有限公司）；BHW-09A Digestor恒温消解仪（上海博通化学科技有限公司）；移液枪（吉尔森科技有限公司）。

1.2 试剂与材料

1.2.1 试剂 碳酸铵（色谱纯，美国 Fluka公司）；硝酸（优级纯，美国Thermo Fisher公司）；氨水（28%～30%，美国Acros Organics公司）；磷酸二氢钾（纯度＞99%，美国 Acros Organics公司）；胰酶（美国Sigma公司）；磷酸（色谱纯，天津市福晨化学试剂厂）；氢氧化钠（优级纯，天津市光复科技发展有限公司）。除非另有说明，本实验所用试剂均为分析纯，水为GB／T 6682规定的一级水。

亚砷酸［三价砷 As（Ⅲ）］、砷酸［五价砷 As（V）］标准溶液：浓度为 1 000 μg／mL，购于上海安谱实验科技股份有限公司；砷胆碱（AsC，GBW08671）、砷甜菜碱（AsB，GBW08670）、二甲基砷（DMA，GBW 08669）和一甲基砷（MMA，GBW08668）标准溶液：均购自中国计量科学研究院；砷标准溶液：浓度为1 000 μg／mL，购于国家有色金属及电子材料分析测试中心。6种砷形态标准储备液制备：用水将各种砷形态稀释成浓度均为1 μg／mL的标液，储存于4℃冰箱中。砷标准工作液和混合标准工作液使用时现配。

1.2.2 材料 50 mL塑料高速离心管；10 mL塑料刻度离心管；水系微孔滤膜（0.22 μm）。

2 方法与结果

2.1 样品预处理

2.1.1 双孢蘑菇提取物 混匀后装入洁净的聚乙烯自封袋中，密封保存备用。

2.1.2 双孢蘑菇鲜品 取样品约500 g，将其可食部分先切碎，经均质器充分搅碎均匀，制得试样装入洁净的聚乙烯自封袋中，密封置于-18℃冰箱中保存备用。

2.2 人工肠液制备 取磷酸二氢钾6.8 g，加水500 mL使溶解，用0.1 mol／L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10 g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至1 000 mL，即得。

2.3 样品提取 取双孢蘑菇样品1.0 g，精密称定，置50 mL塑料高速离心管中，精密加入人工肠液20 mL后于37℃水浴中超声萃取30 min；摇匀，在15 000 r／min条件下离心 10 min；精密量取5 mL上清液于10 mL的刻度离心管中，加水定至10 mL，混匀后过0.22 μm水系微孔滤膜，待测。同法制备空白溶液。

2.4 仪器条件

2.4.1 HPLC测定条件 色谱柱：Hamilton PRP X-100 阴离子分析柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；PRP X-100保护柱。流动相A为0.03 mol／L硝酸铵+0.03 mol／L 磷酸氢二铵（pH：9.0±0.05），流动相 B为 0.001 mol／L 碳酸铵，流速 1.0 mL／min，进样量50 μL，按表 1进行梯度洗脱，运行时间 11 min，柱温：30℃。

表1 梯度洗脱程序

2.4.2 ICP-MS测定条件 功率：1 500 W；高纯氩气为载气；泵速 20 r／min；驻留时间：1 000 ms；采集质量数m／z＝75；采集模式：标准模式；调谐：让仪器达到最佳状态。

2.5 测定 待仪器状态稳定后，测定标准系列工作液和样品待测液。图1为6种砷形态混合标准溶液及样品的色谱图。

图1 6种砷形态混合标准溶液（A）及双孢蘑菇样品（B）的色谱图

2.6 检出限、定量限与线性关系考察 以不低于3倍信噪比（S／N≥3）确定方法检出限（LOD），以 S／N＝10时所对应的浓度作为定量限（LOQ），结果如表 2 所示，6种砷形态的 LOD 为 0.23～0.68 μg／L，LOQ 为 0.75～2.28 μg／L。6种砷形态化合物线性关系考察结果见表2。将6种砷形态混合标液按照浓度从低至高依次进样，结果显示：在一定浓度范围内，6种砷形态化合物的峰面积与浓度均呈良好线性关系，相关系数（r）＞0.999。

表2 6种砷形态的检出限、定量限、线性方程、线性范围及相关系数（r）

2.7 精密度实验 按照“2.4”项下分析条件，将50 μg／L的6种砷形态混合标准溶液重复进样测定6次，记录峰面积。结果6种砷形态峰面积的RSD均小于5.0%，表明仪器精密度良好。

2.8 回收率实验 对双孢蘑菇鲜品及提取物进行回收率实验，各做3个水平的加样回收，每个水平3个平行，测定并计算回收率，结果见表3、表4。平均回收率为82.7%～107%，RSD为1.76%～7.78%。

表3 双孢蘑菇鲜品中6种砷形态的加标回收率

表4 双孢蘑菇提取物中6种砷形态的加标回收率

2.9 双孢蘑菇鲜品及提取物实际样品检测 选购市售双孢蘑菇鲜品及提取物，采用上述建立的HPLC-ICP-MS方法测定6种砷形态，同时采用《食品中总砷及无机砷的测定》［7］中第一篇第一法——电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定总砷含量，结果见表5。表5显示：双孢蘑菇鲜品及提取物中均有6种砷形态检出，砷形态的总量与ICP-MS测得总砷含量相当，双孢蘑菇中的砷主要以AsB的形式存在，占总量62.4%～82.9%。与双孢蘑菇鲜品相比，提取物的砷总量降低，主要体现在AsB含量降低。

3 讨 论

3.1 流动相的选择 根据文献资料，砷形态分析常用流动相有碳酸铵、磷酸氢二铵、乙酸钠+硝酸钾+磷酸二氢钠+EDTA+无水乙醇［7-12］等，但是非挥发性缓冲盐溶液易聚集在透镜和采样锥上，从而导致信号不稳定和“记忆”效应，有机溶剂在ICP中产生的碳也可造成进样管和采样锥、截取锥两锥孔的变小甚至堵塞，影响信号稳定性［13］。碳酸铵因其残留少且长时间使用也无信号漂移成为砷形态分析流动相首选，但实验中发现，仅以碳酸铵溶液作为流动相时，AsC和AsB无法分开，结合文献，并考虑到铵盐对采样锥和截取锥的损伤更小，本实验以碳酸铵溶液和磷酸氢二铵溶液为流动相，同时加入硝酸铵以消除氯离子的干扰。经优化，最终确定0.03 mol／L 硝酸铵+0.03 mol／L 磷酸氢二铵（pH：9.0±0.05）为流动相 A，0.001 mol／L 碳酸铵为流动相B，梯度洗脱。

表5 实际样品检测结果mg／kg

3.2 提取方法的选择 超声提取利用高频机械振动最大限度地使样品分散在提取溶剂中，保证了提取过程中各种砷形态的有效溶出且无交叉污染。以双孢蘑菇提取物为实验样品，以提取效率为考察参数，对超声提取和热浸提两种方法进行比较。结果显示：超声提取测得6种砷形态总量高于热浸提，与热浸提相比，超声提取还具有提取时间短、提取温度低、操作简单等优点。综合考虑，确定采用超声萃取作为样品前处理方式。按照“2.3”项下样品前处理方法，考察不同超声时间对提取结果的影响。超声时间为20 min时，测得各种砷形态含量明显偏低，提取不完全；超声时间为30、40 min时样品中可检出的各种砷形态含量无明显差异，故选择超声时间为30 min。

3.3 提取溶剂的选择 砷形态分析常用提取溶剂有水、水-甲醇、酸等，为减少有机溶剂的引入，排除含有甲醇的提取溶剂。另根据文献资料［14-15］，在人工肠液中砷的溶出量大于水中，故本实验对人工肠液和硝酸、乙酸进行比较，结果发现：以硝酸为提取溶剂，砷形态的保留时间会产生偏移，且硝酸容易氧化低价的砷，使得砷的化学形态发生变化，影响测定效果；而用乙酸提取，提取率明显偏低，As（V）尤为明显，测得量只有人工肠液提取所得As（V）的20%，故选择人工肠液为提取溶剂进行超声萃取。

3.4 标准溶液的稳定性考察 为考察标准溶液的稳定性，将配制好的50 μg／L砷形态混合标准溶液密封、避光、0～4℃保存48 h后与新配制的砷形态混合标准溶液进行比较，发现除DMA峰面积无明显变化外，其余5种砷形态化合物峰面积均有不同程度的变化，以降低为主，其中As（V）基本上转变成毒性更大的 As（Ⅲ），标准工作液需用时新配［4］。

本实验建立了HPLC-ICP-MS同时测定双孢蘑菇珍华片原料双孢蘑菇中 AsC、AsB、As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（V）等6种砷形态化合物的分析方法，确定最佳提取方法为以人工肠液水浴超声30 min提取。该方法线性范围宽、检出限低、重复性好、检测速度快，并通过加标回收实验验证了其适用性、准确性，适用于双孢蘑菇中砷形态的分析检测，有助于了解双孢蘑菇中砷形态的分布，可为双孢蘑菇及其精深加工产品的安全性评价提供一定的依据。