响应面优化食用菌多酚的提取及抗氧化活性评价

王晶波 秦文 王丽媛 杨倬 卓勤 宫照龙 沈葹

摘 要：目的：优化食用菌多酚的超声波法提取工艺，对比不同食用菌多酚的抗氧化活性。方法：以多酚提取率为指标，采用超声波法，通过单因素试验及响应面分析，确定超声波法的最佳工艺流程。采用Folin-Ciocalteu比色法检测多种食用菌的多酚提取率，并以对DPPH·清除能力评价食用菌多酚的抗氧化活性。结果：响应面试验确定超声波法的最佳提取条件为乙醇浓度为85%、超声时间为38 min、液料比为44∶1mL/g，多酚提取率可达5.258 mg/g，与模型理论预测值（5.236 mg/g）的相对误差仅为1.28%，表明该工艺稳定、可靠。食用菌多酚提取率与抗氧化能力检测结果表明，超声波法得到的食用菌多酚都具有抗氧化活性，且抗氧化能力与多酚提取率之间的相关性显著，其中黄牛肝菌单位毫克多酚的DPPH·清除能力最强。结论：通过响应面法优化超声波法提取食用菌多酚的工艺条件，保持了食用菌多酚的抗氧化活性，是一种可行、实用和高效的食用菌多酚提取方法。

关键词：响应面;食用菌多酚;超声波法;抗氧化活性

我国是食用菌生产和消费大国，食用菌的产量十分丰富，在2013年已经达3 169.7万t，占到了全球总产量的70%以上[1]，我国食用菌种类繁多，大型食（药）用菌共有966种[2]，是我国的重要生物资源，也是科学研究的重要类群。食用菌味道鲜美，脂肪含量极低，富含蛋白质、维生素、矿质元素、多糖、多酚、黄酮和生物碱等多种生物活性成分，具有较多的药用价值及较好的保健功能[3-7]。其中，食用菌多酚是食用菌中提取的具有两亲结构和诸多衍生化反应活性的一类次生代谢产物。大量研究表明，食用菌多酚具有抗氧化[8-10]、抗病毒[11]、抗肿瘤[12]和抗菌[13]等作用。多酚的提取方法多种多样，包括经典的有机溶剂提取法[14-15]、超声波法、微波法和酶解法等[16]，提取方法常常受有机溶剂种类及浓度、提取时间、液料比、提取次数等因素的影响，使得多酚提取率的高低不同，耗费的时间、物力以及成本也不同。超声波技术作为一种有效的提取方法，可大大缩短提取时间，提高提取效率，已经广泛应用于天然产物的提取研究[17]。目前，相关研究多采用有机溶剂提取法，超声波法研究得比较少，还需要进一步的深入探索。同时，多酚含量的差异性与食用菌的种类与提取工艺密切相关，优化食用菌多酚的提取工艺、比较不同食用菌的多酚提取率，对于进一步研究食用菌多酚的功能作用提供基础。

本研究以食用菌多酚提取率为指标，先采用单因素试验确定超声波法提取食用菌多酚的因素和水平，再采用响应面法确定超声波法的最佳提取工艺，同时还对比了多种食用菌多酚提取率和抗氧化能力，证实超声波法未破坏食用菌多酚的生物活性，为食用菌多酚的分离纯化、功能性研究和工业化生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

食用菌样品（市售），分别购自云南、河北、北京和吉林，将样品去除杂质沙泥，60 ℃烘干、粉碎，过120目筛后置阴凉干燥处备用。20种食用菌按照顺序分别为灰树花、栗蘑、口蘑、花菇、香菇、红蘑菇、松蘑、元蘑、松毛菌、鹿茸菌、茶树菇、黄牛肝菌、姬松茸、黑松露、鸡油菌、羊肚菌、猴头菇、黑虎掌菌、竹荪和金针菇。

没食子酸标准品（89.9%），中国食品药品检定院;左旋抗坏血酸（SLBL9227V），Sigma Aldrich公司;无水乙醇，北京化工厂;Folin-Ciocalteu试剂、碳酸钠、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2’-连氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、 PBS（pH=7.4），Sigma Aldrich公司;过硫酸钾，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

酶标仪SpectraMax i3x，基因有限公司;离心机Eppendorf Centrifuge 5810R，艾本德中国有限公司;电热恒温鼓风干燥箱DGG-9240B型，上海森信实验仪器有限公司;电子天平METTLER TOLEDO-ME403E，梅特勒-托利多仪器有限公司;KQ-600DB型数控超声波清洗器（功率600w，频率40 000Hz），昆山市超聲仪器有限公司。

1.2 多酚含量检测

采用Folin-Ciocalteu比色法测定，在96孔板上分别加入30 μL的多酚提取液样品、150 μLFolin-Ciocalteu试剂（0.2N）和120 μL碳酸钠溶液（75 g/L），室温暗处反应2h后，在酶标仪于760 nm下测定吸光度，以没食子酸（8.75、17.5、35、70、140、280 μg/mL）为对照品绘制标准曲线，获取多酚含量以每克食用菌中没食子酸当量计。

1.3 超声波法提取食用菌多酚工艺单因素试验

1.3.1 不同乙醇浓度对食用菌多酚提取的影响 称取8份1 g香菇粉末，按照液料比为40∶1、超声时间为30 min，加入不同浓度的乙醇-水溶液，分别为30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %和100 % （v/v），超声提取后4 500 r/min离心15 min，吸取上清液并用70 %乙醇溶液定容至50 mL，测定多酚含量并计算多酚提取率（以每克香菇多酚含量计）。

1.3.2 不同超声时间对食用菌多酚提取的影响 称取8 份1 g香菇粉末，按照液料比为40∶1，加入70%的乙醇溶液，分别超声10、20、30、40、50、60、70、80 min后4 500 r/min离心15 min，吸取上清液并用70%乙醇溶液定容至50 mL，测定多酚含量并计算多酚提取率。

1.3.3 不同液料比对食用菌多酚提取的影响 称取5份1 g香菇粉末，分别按照料液比1∶20、1∶30、1∶40 、1∶50和1∶60加入70%乙醇溶液，超声30 min后4 500 r/min离心15 min，吸取上清液并用70%乙醇溶液定容至100 mL，测定多酚含量并计算多酚提取率。

1.4 超声波法提取食用菌多酚工艺的响应面优化

根据单因素试验分析结果，响应面试验采用香菇干粉1g，选取乙醇浓度（A）、超声时间（B）和液料比（C）这3个因素，以多酚提取率为响应面值，利用Design-Expert 8软件设计三因素三水平17个试验点5个中心点的响应面优化试验（表1）。

1.5 多种食用菌多酚提取率检测

每种食用菌均称取1g干粉，采用响应面法分析得到的最佳工艺条件提取食用菌多酚，重复3次，采用1.2法测定多酚含量，对比20种食用菌的多酚提取率，食用菌多酚提取液-20 ℃保存，1周内待测。

1.6 多种食用菌多酚DPPH·清除能力检测

取15 μL样品多酚提取液于96孔板中，每孔加入225 μL的0.02 mg/mL的DPPH·，室温避光反应15 min，于517 nm测吸光度值，以乙醇代替样品溶液做空白对照，采用抗坏血酸（5、10、20、30、40、50 mg/L）作为阳性对照绘制标准曲线，以抗坏血酸当量（mg AEAC/g）计算多酚含量，同时计算1 g食用菌提取的多酚对DPPH·清除率，计算公式为式（1）：

DPPH·清除率=（OD空白-OD样品）/OD空白*100%（1）

2 结果与分析

2.1 多酚标准曲线的制定

在760nm处测定吸光度值，以没食子酸浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，得标准曲线为y=0.007 5x+0.030 4，R2=0.995 9。

2.2 单因素试验结果与分析

从图1可以看出，随着乙醇浓度、超声时间和液料比的增加，多酚提取率变化比较规则，均为先增加后减少，在乙醇浓度为80%、超声时间为40min和液料比为40∶1时达到最大，因此，乙醇浓度80%、超声时间40min和液料比为40∶1为最佳工艺参数。

2.3 響应面分析法优化食用菌超声波法提取工艺

2.3.1 响应面设计方案 根据单因素试验分析结果，以提高食用菌多酚提取率为目的，考察乙醇浓度（A）、超声时间（B）和液料比（C）对食用菌多酚提取率的影响，按照Box-Behnken试验设计原理，进行三因素三水平的响应面试验（表2）。利用Design-Expert 8软件对表2数据进行二次回归拟合，得到以食用菌多酚提取率为响应值的回归方程：

2.3.2 响应面回归模型方差分析 从表3可以看出，超声波提取食用菌多酚试验模型非常显著（F=22.44，P=0.000 2<0.01），失拟项不显著（F=0.081，P=0.966 7>0.05），R2=0.966 5，R2Adj=0.923 4，表明该模型拟合程度良好，受其他因素影响较小，建模成功，结果可靠，因此可以用该模型对食用菌多酚的超声波法提取工艺条件进行分析和预测。方差分析中的显著性表明，一次项A（P=0.001 4）、C（P=0.004 5）、交互项AC（P=0.001 4）、二次项A2（P=0.001 1）、C2（P<0.000 1）对多酚提取率的影响极显著，交互项BC（P=0.013 7）、二次项B2（P=0.038 3）对多酚提取率的影响显著，而B（P=0.302 9）、交互项AB（P=0.124 6）的P>0.05，说明对结果影响不显著。由方差分析结果中的F值和P值可知，影响食用菌多酚的主次顺序依次为乙醇浓度、液料比和超声时间，其中乙醇浓度和液料比对响应值影响比较大。

2.3.3 响应面图分析与优化 响应面图中等高线图的形状反映了因素间交互作用的强弱，椭圆形表示交互作用显著，圆形表示交互作用不显著;3D曲面图的陡峭程度表明因素对多酚提取率的影响程度，陡峭表明影响大，平缓表明影响小。图2b乙醇浓度和液料比交互作用的响应面坡度陡峭，等高线图是椭圆形，说明二者交互作用极显著;同一乙醇浓度下，随液料比增加，多酚提取率增加，达到最佳后开始减小;与之相比，同一液料比的水平下，随着乙醇浓度增加，多酚提取率增加，达到最佳后开始减小。同理，图2c超声时间和液料比3D曲面图较陡峭，等高线图是椭圆形，说明二者交互作用显著;图2a乙醇浓度和超声时间3D曲面图比较平缓，等高线图近似圆形，说明二者交互作用不显著，这些与响应面模型方差分析结果是一致的。

2.3.4 响应面最佳提取工艺条件和验证试验 通过软件分析得到超声波法提取食用菌多酚最佳工艺参数为乙醇浓度84.97 %、超声时间37.71 min、液料比43.71 mL/g，在此条件下多酚提取率为5.326 mg/g。为了操作方便，修改最佳工艺为乙醇浓度85%、超声时间38 min、液料比44∶1mL/g，在此条件下，进行3次平行试验，所得提取率平均值为5.258 mg/g，实测值与预测值相对误差为1.28 %，说明该优化工艺条件能很好地预测食用菌多酚提取情况。

2.4 20种食用菌多酚提取率和抗氧化能力检测

采用超声波提取法最佳工艺乙醇浓度85 %、超声时间38 min、液料比44∶1mL/g条件下提取20种食用菌多酚，红蘑菇、口蘑、松蘑、黑虎掌菌和姬松茸的多酚提取率高，达到12.33±0.46 mg/g，比多酚提取率低的香菇（5.26±0.10 mg/g）高出2.34倍。此超声波法未破坏食用菌多酚的抗氧化活性，20种食用菌多酚均具有不同程度的抗氧化能力，其中黄牛肝菌、口蘑、松蘑、松毛菌和姬松茸对DPPH·清除能力强，相当于（69.33～56.44mg）抗坏血酸的DPPH·清除能力，对20种食用菌的多酚提取率和DPPH·清除能力进行相关性分析，抗氧化能力与食用菌多酚提取率之间的相关性显著（R=0.774 8），多酚提取率高，抗氧化能力强，其中尤以黄牛肝菌抗氧化能力强，单位毫克多酚的DPPH·清除能力达到7.27 mg AEAC/mg，然后依次是松毛菌、口蘑、姬松茸和松蘑，均具有很强的抗氧化能力（表4）。

3 结论

超声提取法提取主要是利用超声波空化产生的极大压力造成被破碎物细胞壁及整个生物体瞬间破裂，同时超声波产生振动作用加强了细胞内物质的释放、扩散及溶解，加速植物中的有效成分进入溶剂，使其进一步增大了有效成分进入溶剂。所用仪器简单，操作方便，超声波仪自动化程度较高，便于大规模生产[18]。本研究采用响应面法对食用菌多酚超声波法提取条件进行优化，建立了食用菌多酚提取率与乙醇浓度、超声时间和液料比这3种因素的二次回归模型。由该模型确定了超声波法提取食用菌多酚的最佳工艺条件为乙醇浓度85%、超声时间38 min、液料比44∶1mL/g，经验证，该条件下得到的多酚提取率与模型理论值相对误差仅为1.28%，说明该模型能较好地预测实际多酚提取率，用响应面法优化食用菌多酚的超声波法准确可行。另外，超声波法在提取过程中无需高温，避免高温对食用菌多酚分子的结构破坏，能够有效地提取多酚，保持多酚的活性，对比20种食用菌干粉的多酚提取率和DPPH·清除能力，结果表明，抗氧化能力与多酚提取率之间的相关性显著，多酚提取率高，抗氧化能力强，黄牛肝菌单位毫克多酚的DPPH·清除能力最为显著，其次是红乳牛肝菌、口蘑、姬松茸和松蘑，是值得进一步开发研究的食用菌菌种。

综上所述，通过优化提取条件，超声波法提高了食用菌多酚提取量，未破坏多酚的生物活性，是一种可行、实用和高效的食用菌多酚提取方法，可以在食用菌多酚的工业化生产积极推广应用，为今后对食用菌的进一步开发利用和功能研究提供参考。

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