支气管镜冷冻肺活检对肺周围性病变的诊断价值以及辅助检测IFN-γ、IL-4和MMP-9的意义*

吕华亮， 宋一波， 陈智华， 黄世雄， 林月梅， 杨媛媛， 林亚聪， 谭壮丽

茂名市人民医院呼吸内二科(广东茂名 525000)

一般在常规临床、理化、细菌学检查和影像学检查后，若还未获得对肺周围性病变(peripheral pulmonary lesions)明确诊断的，都会需要采用肺活检来进行病理学检查与诊断[1-2]。肺活检也被认为是一种诊断的金标准，是当前不可或缺的一种技术[3]。常用的肺活检方式有外科肺活检、经支气管镜钳夹活检、X线/超声引导下的经皮肺穿刺活检等[4-5]，其中，经支气管镜钳夹活检具有损伤小、可以重复进行等优点，已经成为了周围性病变非常重要的诊断手段，但利用这种方式所获取的组织标本较小，从而大大降低了其临床诊断价值[6]。随着现代医疗技术的发展，经支气管冷冻肺活检(transbronchial cryobiopsy，TBCB)不仅具有损伤小、可重复进行等优点，获取的组织标本也较大，可以很好地满足临床诊断的开展[7-8]，但国内针对支气管镜冷冻肺活检与传统钳夹活检在肺周围性病变的研究较少，特别是利用该技术对肺恶性病变的诊断的准确性和阳性率如何，目前尚无定性，且由于恶性病变的早期症状并不明显，等到发现的时候往往已经进入了中晚期，严重延误和影响了对患者的治疗时机和临床疗效[9]。因此，本研究通过比较分析经支气管镜冷冻肺活检和经支气管镜钳夹活检在周围性病变中的诊断结果、阳性率以及术中出现的出血、气胸等问题，同时，在恶性病变的诊断中，通过辅助检测患者血清中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)的含量差异，以期为肺周围性病变，特别是恶性病变的诊断提供一定的理论依据，探寻一种更为准确的联合诊断方式。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年4月至2018年11月在我院接受诊治的132例肺周围性病变患者作为研究对象，所有患者已知悉本研究的研究方案并签署了知情同意书，本研究已获得我院医院伦理委员会讨论批准。其中男69例，年龄27～79岁，女63例，年龄29～82岁。入组条件：(1)临床和影像资料完整；(2)胸部CT影像学表现为支气管以下病变；(3)签署了知情同意书的患者。剔除条件：(1)凝血功能障碍及严重血液系统疾病的患者；(2)存在心、脑、肾、肺等重要脏器功能障碍患者；(3)多发肺大疱形成及未经有效处理的气胸患者；(4)严重心律失常的患者；(5)不能配合检查和未签署知情同意书的患者。按照检查方法的不同，将所有患者随机分为两组，分别为经支气管冷冻肺活检组(65例)和经支气管钳夹活检组(67例)，两组患者年龄、性别构成比、体质指数(BMI)等一般资料的比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

表1 两组患者一般资料比较

表1 两组患者一般资料比较

组别例数性别(例)男女年龄(岁)BMI(kg/m2)冷冻活检组65353060.4±5.727.9±5.1钳夹活检组67343359.1±6.828.1±4.8

1.2 方法

1.2.1 经支气管镜冷冻肺活检 所有入选患者在术前禁食4 h，保持仰卧位并吸氧，采用心电监测仪监测患者的生命体征。通过超声雾化吸入2%利多卡因进行麻醉或者静脉诱导麻醉，采用K-300多功能冷冻仪(深圳市鑫鹏制冷设备有限公司)进行冷冻活检。具体操作方法如下：在患者麻醉状态下将冷冻探头经软镜的工作通道中插入，探头到达病变部位或紧靠病变内部中心(探头保持距离胸膜至少2 cm)，冷冻3～6 s，当探头周围形成冷冻结晶后，将黏附标本的冷冻探头和软镜一起取出，摘除探头上的病变组织后，若无明显出血或气胸等严重并发症，可再次进入气道重复上述过程继续冷冻取出组织标本，用多聚甲醛固定后进行病理切片检查。观察患者有无出血，并采取相应的止血措施进行处理。

1.2.2 经支气管镜钳夹活检 所有入选患者在术前禁食4 h，保持仰卧位并吸氧，采用心电监护仪监测患者的生命体征。通过超声雾化吸入2%利多卡因进行麻醉或者静脉诱导麻醉，采用BF-IT260型电子支气管镜(由日本OLYMPUS公司生产)行钳夹活检。具体操作方法如下：在患者麻醉状态下，经纤维支气管镜的活检孔插入活检钳，将活检钳送到预定的外周肺病灶进行活检，钳取3块组织，用多聚甲醛固定后进行病理切片检查。

1.2.3 酶联免疫吸附法(ELISA)检测 在空腹状态下，抽取所有患者的静脉血，2 000 r/min，离心5 min，取上清液，严格按照酶联免疫吸附分析法(ELISA)说明书进行操作，检测血清中人γ干扰素(IFN-γ)(武汉华美生物工程有限公司-人IFN-γ ELISA试剂盒)、人白细胞介素-4(IL-4)(武汉华美生物工程有限公司-人IL-4 ELISA试剂盒)以及人基质金属蛋白酶-9(MMP-9)(武汉华美生物工程有限公司-人MMP-9 ELISA试剂盒)的表达水平，辅助病理学结果进行诊断。

1.3 观察指标 (1)活检组织的大小和操作时间长短；(2)病理学检查结果；(3)术中出血情况：轻度出血，出血量少，可自行止血；中度出血，出血量中等，经冰盐水冲洗和1∶10 000肾上腺素局部喷洒等方式进行止血；重度出血，出血量大，常规方式止血效果不佳，需抗原呈递细胞止血或停止操作；(4)检测所有患者血清中IFN-γ、IL-4和MMP-9的表达含量。在病理学检查结果的基础上，分别比较两种活检方式患者血清中IFN-γ、IL-4和MMP-9的含量差异，以及同一种活检方式两组患者血清中3个指标的含量差异。

1.4 统计学方法 利用SPSS 22.0统计软件，计量资料采用Student′st检验，结果以均数±标准差表示；计数资料采用2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者活检组织大小及操作时间比较 两种方式活检获取组织标本的时间组间差异无统计学意义(t=1.04，P>0.05)。与钳夹活检组相比，冷冻活检组获取的组织标本直径明显更大，差异有统计学意义(t=12.43，P<0.05)。见表2。

表2 两组患者活检组织大小及操作时间比较

表2 两组患者活检组织大小及操作时间比较

组别例数组织直径(mm)操作时间(min)冷冻活检组654.02±0.48∗30.29±4.81钳夹活检组671.69±0.4229.76±5.14

*与钳夹活检组比较P<0.05

2.2 两组患者病理学检查结果 132例入选患者经活检获得确诊的阳性率为62.1%。冷冻活检组有44例成功获得组织标本并确诊，确诊的阳性率为67.7%，恶性病变12例，间质性肺疾病15例，肺结核9例，结节病5例，肺泡蛋白沉积症1例，隐源性机化性肺炎2例；而钳夹活检组有38例成功获得组织标本并确诊，确诊的阳性率为56.7%，恶性病变10例，细菌性肺炎9例，肺结核8例，结节病5例，间质性肺疾病2例，隐源性机化性肺炎3例，霉菌感染1例。与钳夹活检组相比，经冷冻活检组确诊的阳性率更高，差异有统计学意义(2=7.215，P<0.05)。

2.3 两组患者出血及气胸情况比较 在手术过程中，两组患者出血和气胸等并发症的发生率差异无统计学意义(2=2.41，P>0.05)。见表3。

表3 两组患者出现出血及气胸情况比较 例(%)

2.4 患者血清中IFN-γ、IL-4和MMP-9的表达情况 从检测结果可以发现，同为良性病变患者或恶性病变患者，不同活检方式对患者血清中IFN-γ、IL-4和MMP-9的含量均差异无统计学意义(P>0.05)，而与良性病变患者相比，恶性病变患者血清中IFN-γ的含量明显降低，IL-4和MMP-9的含量明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。随后，对血清中IFN-γ、IL-4和MMP-9的含量变化与病理学检查结果进行诊断分析发现，在恶性病变的诊断中，IFN-γ辅助诊断的敏感度为78.2%、准确性为81.6%、阈值为142.71 pg/mL；IL-4和MMP-9辅助诊断的敏感度分别为83.2%和82.6%，准确性分别为86.2%和85.4%，阈值分别为123.67和63.62 pg/mL；3个指标联合辅助诊断的准确性高达94.7%。见表5。

表4 不同患者血清中IFN-γ、IL-4和MMP-9的表达情况比较

表4 不同患者血清中IFN-γ、IL-4和MMP-9的表达情况比较

组别IFN-γIL-4MMP-9冷冻活检组 良性病变271.8±21.361.53±9.8227.31±4.52 恶性病变131.4±19.7∗162.70±12.6∗88.64±9.21∗钳夹活检组 良性病变259.6±23.359.57±10.4128.02±5.11 恶性病变128.6±20.4∗165.30±16.8∗89.47±7.84∗

*与良性病变比较P<0.05

表5 不同患者血清中IFN-γ、IL-4和MMP-9的诊断分析结果 %

3 讨论

不同的肺活检方式都有其优缺点，因此，采用何种活检方式来诊断肺周围性病变尚无定论。一般都是根据操作者的个人习惯、熟练程度、病灶部位、病灶范围和取检器械等不同因素来确定手术的方式[1]。其中，经支气管肺活检具有损伤小、可重复进行等优点，已经成为了周围性病变非常重要的诊断手段，但利用这种方式所获取的组织标本较小，且需要反复检查获取，会增加患者痛苦，特别是老年患者的耐受度低、操作风险大等，极大程度影响了其临床诊断价值[6,10]。在20世纪90年代以后，经支气管镜冷冻技术开始广泛应用于气道占位性疾病，特别是良性气道肿物的介入治疗，并取得了良好的效果[11]。2009年Babiak等[12]学者将该技术成功应用于肺活检中，并获得了多个国家的认可和应用。支气管镜冷冻肺活检通过将冷冻探头经软镜的工作通道中插入，探头到达病变部位或紧靠病变内部中心(探头保持距离胸膜至少2 cm)，冷冻3～6 s，当探头周围形成冷冻结晶后，将黏附标本的冷冻探头和软镜一起取出，摘除探头上的病变组织后，若无明显出血或气胸等严重并发症，可再次进入气道重复上述过程继续冷冻取出组织标本，具有创伤小、标本质量高、费用低、并发症少等特点，已经在德国、意大利、美国和中国等多个国家获得了广泛应用[7-8]。在本研究中，经过对结果分析发现，两种活检方式获取组织标本的时间分别为(30.29±4.81)min和(29.76±5.14)min，组间差异无统计学意义(t=1.04，P>0.05)，而与钳夹活检组相比，冷冻活检组获取的组织标本直径明显较大，差异有统计学意义(t=12.43，P<0.05)。同时，对所有患者进行病理学检查发现，经活检获得确诊的阳性率为62.1%。冷冻活检组有44例成功获得组织标本并确诊，确诊的阳性率为67.7%；而钳夹活检组有38例成功获得组织标本并确诊，确诊的阳性率为56.7%。经支气管镜冷冻肺活检确诊的阳性率明显高于钳夹活检组，差异有统计学意义(2=7.215，P<0.05)，表明支气管镜冷冻肺活检能够更有效地对肺周围性病变进行诊断，且获取组织标本更大，患者痛苦感更低，确诊的阳性率更高。此外，在手术过程中，两组患者在手术过程中出血和气胸等并发症的概率差不多，差异无统计学意义(2=2.41，P>0.05)。

但是，在对恶性病变的诊断过程中，研究发现，由于恶性病变的早期症状并不明显，待发现时已是晚期，严重延误了患者的治疗时机，影响了其治疗效果[9]，因此，本研究认为在进行常规的肺活检时，还应该针对恶性病变的一些指标进行辅助检测诊断，以提高对恶性病变的诊断准确性。IFN-γ是一种水溶性二聚体细胞因子，主要由Th1细胞分泌，具有抗病毒、免疫调节和抗肿瘤等活性[13]，是一个非常重要的免疫调节因子，可以激活宿主单核细胞，并促使单核细胞在病灶周围聚集，抑制感染的扩散，有利于结核性肉芽肿形成，还可以刺激巨噬细胞，增强巨噬细胞的杀菌作用。李晓英等[14]研究通过对比不同临床分期非小细胞肺癌外周血中Treg细胞、IL-2、IL-10及IFN-γ的表达水平，发现患者血清中IL-10的升高，IL-2、IFN-γ的表达下调，可能是引发晚期肺癌患者抗肿瘤的免疫低下的原因之一；而李高等[15]研究也发现肺癌患者血清中IL-2、IFN-γ、NKG2D是低表达的，而TNF-α在肺癌患者的血清中则是发生显著上调的。而IL-4是由活化的T细胞产生，主要参与调控机体的体液免疫[16]。研究[17-18]发现IL-4是抑制Th1型细胞因子应答反应和介导Th2型细胞发育的主要细胞因子，当Th2型细胞因子占据优势时，就会保护肿瘤细胞发生免疫逃逸，并且抑制Th1型细胞因子的产生，降低机体的免疫功能，说明IL-4高表达可能是导致肿瘤免疫逃逸的重要原因。因此，监测IL-4和IFN-γ的含量变化对诊断患者是否发生恶性病变具有非常重要的指导意义。此外，MMP-9是属于基质金属蛋白酶家族的一员，其主要功能是维持降解和重塑细胞外基质的动态平衡，还能调节其他蛋白酶及细胞因子的活性，它能降解α1抗胰蛋白酶，保护中性粒细胞弹性蛋白酶活性，能加强胶原质胶体中胶原细胞和MMP-13的溶胶原活动，并且MMP-9还能从白细胞介素-8(CXCL8/CL8)上分解一个62氨基酸肽，使其向中性粒细胞的趋化活性增加10倍，但它也抑制其他中性粒细胞的趋化因子，对肿瘤的生长、侵袭、转移具有重要的作用[19-21]。

因此，为了进一步确定恶性病变的诊断结果，本研究在病理学检查结果的基础上，将诊断为良性疾病的患者作为对照，观察诊断为恶性病变的患者，分别比较两种活检方式患者血清中IFN-γ、IL-4和MMP-9的含量差异，以及同一种活检方式两组患者血清中3个指标的含量差异。从检测结果可以发现，不同活检方式对患者血清中IFN-γ、IL-4和MMP-9的含量差异无统计学意义(P>0.05)，而与良性疾病相比，恶性病变患者血清中IFN-γ的含量明显降低，IL-4和MMP-9的含量明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。随后，对血清中IFN-γ、IL-4和MMP-9的含量变化与病理学检查结果进行诊断分析发现，3个指标联合辅助诊断的敏感度为92.8%，特异度为93.6%，准确性高达94.7%，表明对患者血清中IFN-γ、IL-4和MMP-9的检测能够辅助诊断患者是否发生恶性病变，还可以提高确诊的准确性。

综上所述，通过分析比较经支气管镜冷冻肺活检和支气管镜钳夹活检两种活检方式在周围性病变中的诊断结果、确诊阳性率以及术中出现的出血、气胸等并发症的情况，以及在恶性病变的诊断中，辅助检测患者血清中IFN-γ、IL-4和MMP-9的含量差异，我们发现支气管镜冷冻肺活检在不同类型的肺周围性病变诊断中比传统的钳夹活检具有更高的确诊阳性率，诊断价值更高，同时对恶性病变的诊断中，血清中IFN-γ、IL-4和MMP-9辅助诊断具有非常好的临床指示作用，为恶性病变的诊断提供更为准确的诊断结果，可作为重要的联合诊断方法之一。但由于纳入的病例不多，并没有对不同恶性病变的结果进行深入分析，后续将扩大病例的数量和不同地区患者的诊断结果，以期为患者恶性病变的早期诊断提供一个更加准确的诊断依据和方式。