肾康丸与依那西普对2型糖尿病大鼠肾脏保护的作用机制*

2019-09-09方婉刘雅诗刘龙辉张子鑫刘小玲李燕霞杨爱成

广东医学 2019年16期

方婉，刘雅诗，刘龙辉，张子鑫，刘小玲，李燕霞，杨爱成△

1湖南中医药大学研究生院(湖南长沙 410000)； 2暨南大学附属江门市中医院肾病科(广东江门 529000)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)常见而且较严重的并发症之一就是糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)。DN起病隐匿，早期常无明显临床症状，病情逐渐进展出现高血压、尿蛋白阳性即DN蛋白尿期，最终发展至终末期肾功能衰竭，这是最重要的糖尿病导致死亡的原因之一[1]。肾康丸(Shenkangwan)是魏连波教授通过多年的临床观察有效治疗DN的经验方剂，方药中各单味药均具有或兼具免疫调节作用。前期，笔者从临床研究[2]发现，肾康丸通过减少DN患者炎症因子的产生，从而产生肾保护作用。依那西普(etanercept)是重组人Ⅱ型受体-抗体融合蛋白，是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)拮抗剂，故可以抑制TNF-α，从而有控制炎症、阻断病情进展的作用，它属抗风湿药物(DMARD)，是抗风湿病的生物制剂，对肾脏保护作用。我们于2014年6月至2018年6月开展本研究，通过肾康丸及依那西普作用于T2DM，观察其对于T2DM大鼠肾脏肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)系统表达的影响，为防治DN寻找新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物选取2月龄，体重170～200 g的清洁级近交系Wistar雄性大鼠60只，购买于南方医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2006-0015。

1.1.2 受试药品依那西普(注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白；英文名称：Recombinant Human Tumor Necrosis Factor-Receptor)，12.5 mg/支。肾康丸(组成：黄芪、芡实、金樱子、玉米须等)，6 g/包。

1.1.3 主要试剂链脲佐菌素(STZ)；柠檬酸缓冲液；10%水合氯醛；10%甲醛；血清尿微量清蛋白(UmAlb) ELISA及尿α1-微球蛋白(Uα1-MG)试剂盒；普通PCR试剂，重组鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)、Trizol，Q-RT-PCR试剂。

1.2 动物模型制备根据文献，制作T2DM大鼠模型。所有大鼠均自由进水，适应性喂养7 d后随机将其分为两组：正常对照组(C组) 12只，模型组(D组)48只，分别给予标准饲料及高脂高糖饲料(标准饲料∶蔗糖∶炼猪油∶奶粉∶鸡蛋=63.5%∶20%∶10%∶4%∶2.5%)喂养。4周后，在大鼠空腹状态下(所有大鼠禁食12 h)，C组注射柠檬酸缓冲液(30 mg/kg)，D组大鼠腹腔注射等量的STZ，注射72 h后尾静脉采血测血糖，连续2次空腹血糖(FBG)≥13.5 mmol/L者即为T2DM大鼠模型成功。

1.3 动物分组从造模成功的D组大鼠中选择36只符合DM诊断标准的大鼠，随机分配将其分为3组：DM模型组(DM组)12只,依那西普治疗组(DE组)12只，肾康丸治疗组(DS组)12只。DE组大鼠给予腹部皮下注射依那西普(剂量2 mg/kg，1周2次)；DS组大鼠予肾康丸(350 mg/d，相当于成人18 g/d)灌胃。C组和DM组大鼠灌服相应体积的生理盐水。实验期间C组大鼠、D组所有大鼠继续分别予标准饲料喂养、高脂高糖饲料喂养。实验室室温保持在20～24℃，相对湿度维持在40%。

1.4 标本收集、处理给予药物第4周时，从每组大鼠中随机选6只大鼠留取尿液；于处死前1 d对此6只大鼠禁食12 h后并称体重，选取腹主动脉采血(10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉动物)，分离血清，-20℃保存。处死大鼠选取左侧肾脏，称得肾脏重量，沿正中矢状面剖开，用PBS冲洗干净，去包膜，10%甲醛中性缓冲液固定以做HE染色，取右肾放入液氮保存，用于Q-RT-PCR检测。给予药物第8周时，每组另外6只大鼠按上述方法处理。

1.5 检测指标

1.5.1 血清生化指标全自动生化分析仪检测大鼠血肌酐(Scr)、尿素(BUN)、FBG。

1.5.2 尿液标本 ELISA试剂检测Uα1-MG和24 h UmAlb。

1.5.3 Q-RT-PCR检测TNF-α、TRAILT、DR4、DcR2在各大鼠肾组织的表达采用Sybrgreen染料法，以β-actin为内参基因，对于观察指标在肾组织的表达量进行检测。首先设计并合成Q-RT-PCR引物，序列如下：β-actin(EF-156276)：β-actin-F 5′-CCAAC-CGTGAAAAGATGACCC-3′，长度21 bp，扩增长度113 bp；β-actin-R 5′-AATGCCAGTGGTACGACCAGAG-3′，长度22 bp。DcR2(NM-003840)：DcR2-F 5′-ATCTGCTCAGGTGGTGGA-3′，长度18 bp，扩增长度118 bp ；DcR2-R 5′-TACTCAGGGTCTCGTTGC-3′，长度18 bp。DR4(NM-0038 44)：DR4-F 5′-TGTTGCATCGG-CTCAGGTTG-3′，长度20 bp，扩增长度132 bp；DR4-R 5′-CGAGTCTGCGTTGCTCAGAA-3′，长度20 bp。TRAIL(NM-14 5681)：TRAIL-F 5′-GAAGAGTGCCAGA AATAGC-3′，长度19 bp，扩增长度140 bp；TRAIL-R 5′-GGTCCAGGTCCATCAAAT-3′，长度18 bp。然后行总RNA抽提，再经过逆转录反应、普通PCR反应后，进行实时荧光定量PCR检测。制作标准曲线，用PCR仪检测，根据标准曲线公式计算样本拷贝数。

1.5.4 大鼠肾脏病理学 HE染色法在显微镜下观察拍照(取甲醛中性缓冲液中保存的左肾石蜡包埋，经脱水、浸蜡包埋、组织切片、染色)。

2 结果

2.1 治疗后各组大鼠血生化变化给药第4周，D组大鼠BUN均升高，与C组比较其差异均有统计学意义(P<0.01)；DM组BUN与DS组、DE组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，而DS组与DE组比较差异无统计学意义(P>0.05)。给药第8周后，D组与C组对比差异均有统计学意义(P<0.05)；DM组与其他各组比较差异有统计学意义 (P<0.01)；DS组BUN较DE组降低，其差异有统计学意义(P<0.01)。

给药后第4周，D组大鼠Scr均升高，C组与DM组、DS组比较差异有统计学意义(P<0.01)；DE组与C组比较差异无统计学意义(P>0.05)，与DM组、DS组比较差异有统计学意义(P<0.01)；DS组与DM组比较差异无统计学意义(P>0.05)。给药后第8周，DM组Scr进一步升高，与其他3组比较差异均有统计学意义(P<0.01)；DS组与C组、DE组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

给药后第4周、第8周，相比于C组，D组大鼠FBG明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；第4周相比于DM组，DS组、DE组大鼠FBG降低，第8周时更明显，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 治疗后各组大鼠BUN、Scr、FBG变化

组别nBUN(mmol/L)Scr(μmol/L)FBG(mmol/L)4周8周4周8周4周8周C组65.53±1.155.20±0.7349.18±4.7450.35±5.165.23±0.525.18±0.41DM组612.38±1.68∗∗15.76±2.45∗75.43±11.07∗∗▲81.57±10.01∗∗22.65±3.35∗∗22.99±2.15∗∗DS组610.25±1.36∗∗△7.74±1.58∗△△69.27±8.60∗∗▲55.68±9.97△△20.02±1.63∗∗18.92±2.53∗∗DE组610.07±2.37∗∗△9.88±1.81∗△△50.67±6.0651.50±3.39△△20.78±5.85∗∗16.68±6.77∗∗

与C组比较*P<0.05,**P<0.01；与DM组比较△P<0.05,△△P<0.01；▲与DE组比较P<0.01

2.2 治疗后各组大鼠Uα1-MG、UmAlb变化治疗后第4、8周，D组大鼠Uα1-MG明显升高，与C组比较差异有统计学意义(P<0.01)；DM组与DS组、DE组对比，差异有统计学意义(P<0.01,P<0.01)。DS组与DE组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

治疗后第4、8周，D组大鼠UmAlb升高，DM组升高最显著，与各组比较差异有统计学意义(P<0.01)；C组与DS组、DE组比较差异无统计学意义(P>0.05)；DS组与DE组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 治疗后各组大鼠Uα1-MG、UmAlb比较

组别nUα1-MGUmAlb4周8周4周8周C组60.38±0.030.41±0.049.13±2.45△9.81±2.94△DM组61.51±0.15∗2.38±0.23∗17.85±2.6323.26±3.65DS组60.82±0.08∗△1.09±0.18∗△9.74±2.10△11.68±3.19△DE组60.81±0.09∗△1.06±0.14∗△9.78±2.41△11.73±2.62△

*与C组比较P<0.01；△与DM组比较P<0.01

2.3 治疗后各组大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变化治疗后第4、8周，DM组TNF-α mRNA表达明显升高，与其余3组相比差异有统计学意义(P<0.01)；C组与DS组比差异有统计学意义(P<0.05)，与DE比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

第4、8周时，实验中的C组TRAIL mRNA表达明显较其他组别高，与DM组、DS组、DE组比差异均有统计学意义(P<0.01)；DM组与DS组比差异有统计学意义(P<0.01)，与DE组比较差异无统计学意义(P>0.05)；DE组与DS组比差异有统计学意义(P<0.01)。见表4。

表3 各组大鼠治疗后TNF-α mRNA变化比较

组别n4周8周C组60.59±0.12△0.63±0.25△DM组61.48±0.161.54±0.30DS组60.92±0.33△▲1.02±0.25△▲DE组60.73±0.35△0.72±0.23△

△与DM组比较P<0.01；▲与C组比较P<0.05

第4、8周时，实验中C组DR4 mRNA表达明显升高，与DM组、DS组、DE组比差异均有统计学意义(P<0.01)；DM组与DS组比差异有统计学意义(P<0.01)，与DE组比较差异无统计学意义(P>0.05)；DE组与DS组比差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

第4、8周时，实验中C组DcR2 mRNA呈低表达，与DM组、DS组、DE组比差异均有统计学意义(P<0.01)；DM组呈高表达，与DS组、DE组比差异有统计学意义(P<0.01)；相对比DS组，DE组差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 TRAIL mRNA、DR4 mRNA、DcR2 mRNA在各组大鼠肾组织的表达

组别nTRAILmRNADR4mRNADcR2mRNA4周8周4周8周4周8周C组62.33±0.272.35±0.331.96±0.201.99±0.410.69±0.080.71±0.11DM组60.56±0.13∗0.71±0.18∗0.53±0.07∗0.71±0.26∗1.77±0.28∗1.95±0.29∗DS组61.16±0.23∗△1.25±0.23∗△1.06±0.40∗△1.16±0.29∗△1.18±0.24∗△0.96±0.20∗△DE组60.67±0.14∗∗0.74±0.15∗▲0.64±0.38∗▲▲0.67±0.27∗▲▲1.19±0.34∗△1.35±0.19∗△

*与C组比较P<0.01；△与DM组比较P<0.01；与DS组比较▲P<0.05,▲▲P<0.01

2.4 各组大鼠肾脏光镜下病理表现光镜下见正常对照C组大鼠肾小球结构清晰，未见增生及萎缩，球囊壁光滑，细胞外基质与系膜细胞分布正常，毛细血管腔清晰。第4周时光镜下见DM组大鼠肾小球明显增大，肾小球肿胀、空泡变性，部分肾小球GBM增厚、肾小球系膜增宽；第8周时，上述改变更加明显。经药物治疗后大鼠肾脏病变较DM组减轻，其中DS组最明显，DE组次之，表现为肾小球肥大减轻，肾小球GBM增厚、肾小球系膜增宽有所改善。见图1。

3 讨论

糖尿病患者中有25%～40%最终出现DN[3]。DN是糖尿病最常见的微血管并发症之一,是引起终末期肾病(end-stage renal disease, ESRD)的主要原因,是1型糖尿病的主要死因，是严重威胁患者生命健康的首要原因[4-5]。DN在古代祖国医学尚未统一名字，中医的“肾消”、“水肿”、“肾劳”、“关格”等病的症状与DN相似，《素问奇病论》首次出现消渴之名，汉代张仲景《金匮要略》首见消渴肾病：“男子消渴，小便反多，以饮一斗，小便一斗，肾气丸主之”。现代医家吕仁及任继学、南征等研究了大量文献，结合临床实际和现代医学的有关知识，提出将本病定名为：“消渴肾病”[6]。

DN本虚标实，肾康丸方含有黄芪益气健脾，芡实、金樱子滋阴补肾兼固涩，滋而不腻，以益气养阴固肾；蝉蜕、玉米须利尿泻热以祛湿热毒；水蛭、益母草、山楂活血通络祛瘀，全方标本同治，在固护肾阴虚同时解血瘀热毒之标。其中黄芪、金樱子等已经被证实具有降血糖的功效，对糖尿病患者有肾保护作用。

目前大多数人认为[7-8]UmAlb增加是肾脏损伤的重要标志，是反映肾小球受损的敏感指标，肾小管损害的程度可通过Uα1-MG即DN早期诊断的敏感指标来准确地判断, 故本实验以Uα1-MG及UmAlb作为早期DN的检测指标。本研究结果显示,DM组大鼠尿mAlb和尿α1-MG呈持续升高趋势，DS组第4周即显示其可以减少DM大鼠尿mAlb和α1-MG的作用，在第8周更加明显，DE组与之有相近的作用。肾康丸及依那西普能改善T2DM2大鼠早期一般状况，降低大鼠血糖，减少尿微量蛋白、尿α1-MG的排泄，改善大鼠肾功能，具有肾脏保护作用。通过治疗，可减轻肾脏病理损害(图1)，表现为肾小球肥大减轻，肾小球GBM增厚、肾小球系膜增宽有所改善，系膜细胞增生减轻；肾小管肥大、肾间质水肿减轻。

DM的发生、发展与TRAIL系统密切相关，TRAIL系统是TNF超家族新成员，通过介导受体表达参与细胞凋亡信号转导调控。TRAIL诱导细胞的凋亡是通过与细胞表面的死亡受体(Death Recepter, DR)中的DR4、DR5与TRAIL与高度特异性结合，通过受体的胞内死亡结构域启动细胞凋亡途径，但其抑制细胞凋亡是通过与诱骗受体(decoy receptor, DcR)中的DcR1、DcR2结合。有实验研究提示[9]，DM大鼠肾脏细胞凋亡明显增加，主要发生在肾小管细胞，且TRAIL、DR4、DR5可能参与DM大鼠肾脏细胞凋亡的发生。在正常肾组织中DcR1没有表达[10]，DR4和DR5在功能上非常相近，且DR4与TRAIL在肾组织表达情况相似，故本研究通过检测DR4 mRNA、DcR2 mRNA、TRAIL mRNA以了解TRAIL系统对细胞凋亡的调控。本研究中，各治疗组大鼠TNF-α mRNA在肾组织表达均减少，而依那西普在第4周即出现对TNF-α表达的明显抑制作用，并且持续到第8周。干预治疗后，DS组TRAIL和DR4在第4周、第8周均较治疗前及DM组明显增加；同时，DcR2的表达也发生了下调。DE组TRAIL和DR4的表达增加不明显，与DM组大鼠比较无统计学差异，其表达量显著低于DS组；DcR2的表达有类似的现象。由此可证明，肾康丸与依那西普对肾脏保护的作用机制并不一致，肾康丸可减少TNF-α在早期DN肾脏的表达，上调TRAIL及其受体DR4的表达，抑制DcR2的表达，对肾脏有保护性作用。有研究称[11]，高糖环境下，肾小球内皮细胞极易受损，炎症因子激活，可诱导TNF-α等表达增加，直接破坏肾小球滤过屏障，导致直接的肾损害，在DM的发生、发展中起关键作用。依那西普是一种TNF-α拮抗剂[12]，可减少TNF-α mRNA的表达，阻断关键性炎症因子TNF-α与其受体结合，减少多转导途径引起炎症因子(IL-6、CRP等)升高，从而减轻炎症反应，血管平滑肌细胞增殖得到抑制，肾脏血管病变减轻，本研究证实了其对肾组织TNF-α特异性的阻断作用，从而对肾脏的保护作用。