RP-HPLC同时测定治胃丸中2种有效成分含量

汪 杰，黄祖光，陈焕擂

0 引言

治胃丸是我院院内制剂，由陈皮、白芍、枳实、木香、砂仁、元胡、柴胡、郁金、甘草、木蝴蝶、黄芩、延胡索组成，临床上主要用于治疗各型胃炎、胃溃疡及十二指肠溃疡等症，具有行气解郁、和胃止痛的功效。方中陈皮为芸香科植物橘及其栽培变种的干燥成熟果皮，用于脘腹胀满、食少吐泻、咳嗽痰多，具有理气健脾、燥湿化痰的功效[1]。白芍用于腹痛、血虚萎黄、头晕目眩等症，具有养血调经、敛阴止汗、平抑肝阳的功效[2]。目前，治胃丸的质量标准中缺少含量测定项，难以保障临床用药的有效性。研究表明，陈皮、白芍的主要活性成分橙皮苷、芍药苷具有与该复方制剂功能相关的药理活性[3-4]。因此，本研究建立反相高效液相色谱(Reversed-phase high performance liquid chromatogr，RP-HPLC)法同时检测治胃丸中橙皮苷、芍药苷的含量，旨在为提高其质控水平提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料 治胃丸(本院制剂，规格：42 g/瓶)，橙皮苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110721-201316)，芍药苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110736-201337)，水为重蒸水。乙腈、甲醇、碳酸均来自德国merck公司，其中乙腈为色谱纯，甲醇和碳酸为分析纯。

1.2 仪器 日本岛津LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津仪器有限公司，仪器配置：LC-20A高压泵，CTO-20A柱温箱，DGU-20A5脱气机，SPD-M20A 二极管阵列紫外检测器，LC-solution色谱工作站)，AEG-220型电子分析天平(日本岛津仪器有限公司)，KQ-300型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司，功率300 W，频率40 kHz)，Synergi Hydro-RP C18色谱柱(广州菲罗门科技仪器有限公司，250 mm×4.6 mm，4 μm)。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 Synergi Hydro-RP C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，4 μm)，以乙腈为流动相A，0.1%碳酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱程序：0～40 min，15%→25%(A%)，85%→75%(B%)，流速：1.0 ml/min，检测波长230 nm，进样量10 μl，柱温35 ℃。

2.2 对照品储备溶液的制备 精密称取适量橙皮苷对照品，加甲醇制成0.2 mg/ml的橙皮苷对照品溶液(每1 ml溶液含橙皮苷0.2 mg)；另精密称取适量芍药苷对照品，加甲醇制成0.1 mg/ml芍药苷对照品溶液(每1 ml溶液含芍药苷0.1 mg)。

2.3 供试品溶液的制备 取适量治胃丸，研细，精密称取细粉1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100 ml，并称重。超声处理30 min，室温放冷后，再次称重，用甲醇补重，滤过，去滤过液，过0.45 μm微孔滤膜，供试品溶液制备完成。按处方比例分别称取除橙皮、芍药以外的其余药物，按照治胃丸制作方法分别制作不含橙皮与不含芍药的丸剂，按照治胃丸供试品溶液制备方式制备出无橙皮对照品溶液与无芍药对照品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 分别精密吸取橙皮苷对照品溶液、芍药苷对照品溶液、治胃丸供试品溶液、无橙皮对照品溶液及无芍药对照品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项中色谱条件进行测定，记录色谱图。图谱显示，治胃丸供试品溶液色谱图中橙皮苷、芍药苷色谱峰保留时间与橙皮苷、芍药苷对照品溶液中基本一致，且无橙皮对照品溶液与无芍药对照品溶液无干扰。见图1。

2.4.2 线性关系考察 精密吸取上述配制好的橙皮苷对照品溶液1、3，5、8、10、12 ml分别置入25 ml容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀。稀释后橙皮苷质量浓度分别为：8、24、40、64、80、96 μg/ml；另精密吸取芍药苷对照品溶液0.25、1、1.5、2.5、3.5、4 ml，分别置入25 ml容量瓶中，加甲醇稀释。芍药苷质量浓度分别为：1、4、6、10、14、16 μg/ml。分别精密吸取各对照品稀释后溶液10 μl，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项中色谱条件进行测定。分别以橙皮苷、芍药苷峰面积(Y)为纵坐标，质量浓度(μg/ml)为横坐标(X)绘制标准曲线(线性回归法)，并计算回归方程。结果橙皮苷质量浓度在8.35～83.52 μg/ml范围内线性关系良好，芍药苷质量浓度在1.51～15.1 μg/ml范围内线性关系良好。见表1。

表1 线性关系考察结果(n=6)

图1 反相高效液相色谱图

2.4.3 精密度试验 精密吸取橙皮苷对照品溶液和芍药苷对照品溶液，分别按“2.1”项中色谱条件重复进样6次，每次进样量10 μl，观察并记录橙皮苷、芍药苷色谱峰的峰面积，并计算各峰面积的RSD。结果橙皮苷峰面积的RSD为0.86%，芍药苷峰面积的RSD为1.8%，显示仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取治胃丸供试品溶液，分别于0、4、10、12、24 h注入高效液相色谱仪，每次进样量10 μl，按“2.1”项中色谱条件进行测定，分别记录橙皮苷、芍药苷峰面积，并计算各峰面积的RSD。结果橙皮苷峰面积的RSD为1.2%，芍药苷峰面积的RSD为1.5%，显示治胃丸供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验 取同一批号的治胃丸供试品(批号：170502)共6份，按“2.3”项中供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项中色谱条件进样分析，计算治胃丸中橙皮苷、芍药苷峰面积的RSD。结果治胃丸中橙皮苷峰面积的RSD为1.4%，芍药苷峰面积的RSD为1.9%，显示该方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 取已提前测定橙皮苷、芍药苷含量的治胃丸样本6份，分别研细，精密称定细粉约0.5 g，置具塞锥形瓶中。分别加入适量橙皮苷、芍药苷对照品，按“2.3”项中方法制备供试品溶液，按“2.1”项中色谱条件进样分析，分别记录橙皮苷、芍药苷色谱峰的峰面积，计算加样回收率。结果显示，该方法准确度高。见表2。

2.5 样品测定 取6个不同批号治胃丸供试品，分别按“2.3”项中方法制备供试品溶液，按“2.1”项中色谱条件进样检测，测定各批号治胃丸供试品中橙皮苷、芍药苷的含量，每个样本进行3次重复，以标准曲线法计算橙皮苷、芍药苷的含量。结果见表3。

3 讨论

3.1 检测指标的选择 橙皮苷是一种黄酮类化合物，有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、调节免疫力、祛痰平喘、保护心血管系统等多种药理活性[5-6]。动物模型实验表明，橙皮苷可通过促进大鼠胃泌素分泌，抑制乙酰胆碱、血管活性肠肽等分泌，促进胃肠运动，是陈皮发挥促胃肠动力的主要药效成分之一[7]。芍药苷具有镇静、解痉、抗炎、抗应激性溃疡、扩张冠脉血管、对抗急性心肌缺血以及抑制血小板凝聚等多方面的作用，是白芍柔肝解郁功效的主要有效成分之一[8-9]。研究表明，在胃痛、咳嗽等病症处方中常采用陈皮与白芍、枳壳等配伍发挥药效协同作用[10-11]。因此，选取橙皮苷和芍药苷作为治胃丸质量控制的检测指标。

表3 样品含量测定结果(mg/g)

3.2 供试品溶液制备条件考察 本研究在样品提取过程中分别考察了甲醇、水、乙醇、50%乙醇和70%甲醇等溶剂对提取率的影响，结果甲醇提取率高，效果最好。同时比较了回流提取和超声提取2种提取方法，结果超声提取操作简便，提取效果最佳。因此最终确定以甲醇为提取溶剂进行超声处理30 min，提取完全且提取液易处理。

3.3 色谱条件考察 本研究在实验过程中参考相关文献报道分别考察了甲醇-0.5%冰醋酸水溶液(64∶36)[12]、乙腈-水(20∶80)[13]、甲醇(A)-0.2%磷酸水溶液(B)[14]等流动相系统的梯度洗脱效果，结果分离度均达不到要求。而采用乙腈-0.1%磷酸为流动相进行梯度洗脱[15]，橙皮苷和芍药苷的色谱峰拖尾因子(T)均符合要求，能明显改善待测色谱峰的分离度。此外，本文还考察了多种型号的反相硅胶色谱柱，结果采用Synergi Hydro-RP C18(250 mm×4.6 mm，4 μm)柱干扰峰少，取得了良好的分离效果。

3.4 含量测定结果分析 本研究按照上述试验条件检测了不同批号治胃丸样品中橙皮苷、芍药苷的含量，结果橙皮苷平均含量5.6 mg/g，芍药苷平均含量1.6 mg/g，且各批号样品之间差异不明显。因此，笔者建议将橙皮苷、芍药苷的含量测定限度规定为每1 g治胃丸中橙皮苷、芍药苷的含量分别不低于4.5 mg/g、1.3 mg/g(下浮20%)。

综上所述，本研究建立的RP-HPLC方法操作简便、快速，重复性好，可作为治胃丸的定量检测方法。考虑到治胃丸处方中药味众多，今后还应建立其他成分含量测定的方法，以进一步提高、完善治胃丸的质量标准，确保药品质量稳定可控。