曲马多复合加巴喷丁对糖尿病神经病理性疼痛大鼠脊髓胶质细胞活化的影响

姚 杰，刘 斐，高 艳，庞茜茜，郭 颖，滕金亮

0 引言

糖尿病神经病理性疼痛(Diabetic neuropathic pain，DNP)是一类较难治疗的疼痛类型，大约有50%的糖尿病患者有不同程度的疼痛发生[1]。作为治疗DNP的一线药物，加巴喷丁的镇痛作用机制尚未明确。有研究表明，其可能的作用机制是抑制大鼠脊髓星状胶质细胞和小胶质细胞的活化，从而减轻神经病理性疼痛[2]。但临床上单独应用加巴喷丁的镇痛效果不够理想，需要联合应用其他治疗慢性疼痛的药物来达到较好的镇痛效果以及减少大剂量使用加巴喷丁带来的不良反应。曲马多是一种选择性中枢μ受体激动剂[3]。本研究通过建立1型糖尿病大鼠神经病理性疼痛模型，分组给药后观察曲马多复合加巴喷丁对DNP的镇痛效应，以及对DNP大鼠脊髓胶质细胞活化和炎症因子表达的影响，进一步探讨曲马多联合加巴喷丁治疗DNP的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠，6～7周龄，体重200～220 g，动物许可证号：SYXK(沪)2017-0019，由中国人民解放军海军医学研究所提供。

主要试剂：链脲佐菌素(STZ)，CAS号：18883-66-4，货号：S6838，规格：100 mg/瓶，购自北京诺博莱德科技有限公司。使用时采用柠檬酸钠缓冲液(pH值4.2～4.5)配制成6 mg/ml STZ溶液，置于冰上避光保存，并于30 min内使用；盐酸曲马多注射液(批号：105902，湖北潜江制药股份有限公司)；加巴喷丁(批号：170206BD，江苏恒瑞医药股份有限公司)；水合氯醛，购自成都嘉叶生物科技有限公司；小鼠抗大鼠小胶质细胞IBal抗体(北京中杉金桥公司)，兔抗大鼠星状胶质细胞GFAP抗体(北京中杉金桥公司)，山羊抗小鼠FITC荧光二抗(北京中杉金桥公司)；TNF-α和IL-1的ELISA试剂盒(批号：CSB-E13482、CSB-E14754，武汉博士德生物有限公司)。

主要仪器：电子Von Frey测痛仪 (North coast公司)，BME-410A热照射疼痛刺激仪(中国医学科学院生物医学工程研究所)，血糖测量仪及试纸(三诺公司)。

1.2 动物模型制备 选择健康雄性SD大鼠48只，动物饲养环境安静，通风良好，室温约23 ℃，相对湿度50%，明暗周期交替，实验动物可自由摄取食物及饮水，3 d后实验动物适应环境开始进行实验。1型糖尿病模型的建立是通过腹腔注射链脲佐菌(60 mg/kg)，注药后第3天取大鼠尾部血液测定血糖，大鼠血糖高于15.5 mmol/L，视为1型糖尿病建模成功[4]。继续饲养3周后，测定大鼠后足机械缩足阈值(PWT)，PWT<80%基础值即为糖尿病神经病理性疼痛模型建立成功，此次有40只大鼠造模成功，糖尿病大鼠发生神经病理性疼痛的比例是87%。

1.3 动物分组及给药 采取随机数字表的方法分成4组(每组10只)：A组(生理盐水组)、B组(曲马多20 mg/kg组)、C组(加巴喷丁60 mg/kg组)及D组(曲马多10 mg/kg+加巴喷丁30 mg/kg组)。

1.4 行为学测定 测定给药前1 d (T0)及给药后3 d (T1)、7 d (T2)、11 d (T3)时PWT和热缩足潜伏期(PWL)。参照文献[4]采用的方法测定PWT。将准备测试大鼠放置于带金属网格的有机玻璃笼，环境保持安静，待其适应环境30 min后，使用Von Frey测痛仪的刺激针刺激大鼠左侧足底，记录被测大鼠缩足前最大垂直压力，即为大鼠的PWT。重复刺激3次，间隔大于10 s，取其平均值作为PWT。参照文献[5]采用的方法测定PWL。将准备测试大鼠放置于带金属网格的有机玻璃笼，环境保持安静，待其适应环境30 min后，使用BME-410A热照射疼痛刺激仪照射大鼠左侧足底，记录被测大鼠从开始照射至出现缩足反应的时间，即为大鼠的PWL。重复刺激3次，间隔5 min，取其平均值作为PWL。

1.5 胶质细胞免疫荧光双染 大鼠行为学PWT和PWL测试结束后，在各组随机抽取5只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，开胸，经心脏生理盐水快速灌注，4%多聚甲醛灌注固定，分离并取脊髓腰膨大段组织，标本置于4%多聚甲醛固定3 h后，30%蔗糖梯度脱水，石蜡包埋，冰冻，制成10 μm石蜡切片，漂洗后封闭。二甲苯脱蜡，组织抗原修复，双氧水封闭内源性过氧化物酶；滴加5%的BSA常温封闭1 h，分别滴加一抗(Iba-1，浓度1∶200)和一抗(GFAP，浓度1∶200)，4 ℃过夜。次日PBS冲洗，加二抗，DAB显色，苏木精复染，阴性对照用PBS代替，树胶封片后显微镜下拍片观察实验结果，含有棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞。采用LEICAQ500MC图像分析系统，在脊髓背角深层和浅层分别选取脊髓内侧固定区域250 μm×250 μm范围，计数阳性细胞，反映星状胶质细胞和小胶质细胞活化水平。

1.6 ELISA法检测TNF-α和IL-1含量 取清洗后的大鼠脊髓腰膨大段组织，加入5 ml预冷PBS冲洗研磨，离心5 min后取上清液，采用相应的试剂盒检测脊髓提取液中的TNF-α、IL-1含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。

2 结果

2.1 不同治疗组各时间点PWT的比较 各组大鼠T0时PWT比较差异无统计学意义(P>0.05)。与T0时比较，A组T1～T3时PWT差异无统计学意义(P>0.05)。B组T1～T3时PWT略有上升，差异无统计学意义(P>0.05)。C组T2时PWT升高，差异有统计学意义(P<0.05)。D组T2、T3时PWT升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与A组比较，C组和D组PWT升高(P<0.05)；与B组比较，C组和D组PWT升高(P<0.05)；与C组比较，D组T3时PWT升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 不同治疗组各时间点PWL的比较 各组大鼠T0时PWL比较差异无统计学意义(P>0.05)。与T0时比较，A组T1～T3时PWL差异无统计学意义(P>0.05)。B组T2时PWL延长，差异有统计学意义(P<0.05)。C组T1、T2时PWL均延长，差异有统计学意义(P<0.05)。D组T1～T3时PWL延长，差异有统计学意义(P<0.05)。与A组比较，B组T2时PWL延长；C组T1、T2时PWL延长；D组T1～T3时PWL延长，差异有统计学意义(P<0.05)。与B组比较，D组T3时PWL延长(P<0.05)；与C组比较，D组T3时PWL延长(P<0.05)。见表2。

表1 各组糖尿病神经病理性疼痛大鼠PWT比较(mN)

注：△与T0时比较，P<0.05；*与A组比较，P<0.05；#与B组比较，P<0.05；&与C组比较，P<0.05

表2 不同治疗组糖尿病神经病理性疼痛大鼠PWL比较(s)

注：△与T0时比较，P<0.05；*与A组比较，P<0.05；#与B组比较，P<0.05；&与C组比较，P<0.05

2.3 不同治疗组脊髓内胶质细胞活化水平的比较 与A组比较，B组、C组、D组大鼠脊髓内星状胶质细胞和小胶质细胞活化水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与B组比较，C组大鼠脊髓内星状胶质细胞和小胶质细胞活化水平略降低，差异无统计学意义(P>0.05)，D组大鼠脊髓内星状胶质细胞和小胶质细胞活化水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与C组比较，D组大鼠脊髓内星状胶质细胞和小胶质细胞活化水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同治疗组脊髓胶质细胞活化水平比较(个)

注：*与A组比较，P<0.05；#与B组比较，P<0.05；&与C组比较，P<0.05

2.4 不同治疗组大鼠脊髓TNF-α、IL-1含量的变化 与A组比较，B组、C组、D组大鼠脊髓TNF-α、IL-1的表达降低明显，差异有统计学意义(P<0.05)。与B组、C组比较，D组大鼠脊髓TNF-α、IL-1的表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 不同治疗组大鼠脊髓TNF-α、IL-1含量变化(ng/ml)

注：*与A组比较，P<0.05；#与B组比较，P<0.05；&与C组比较，P<0.05

3 讨论

糖尿病已经成为我国重大公共卫生问题，DNP作为糖尿病的常见慢性并发症，其临床表现主要为自发疼痛和痛觉敏化[6]。目前，临床上DNP的患者数量增加，长期的疼痛不适对患者的身心造成严重的损害。DNP的发病机制复杂，目前尚无有效的治疗方案。以往对于DNP治疗的研究大多集中在单独应用加巴喷丁[7]，作为推荐使用的治疗DNP的一线药物[8]，其作用机制可能是通过中枢性镇痛与抑制影响损伤后外周神经异位放电的作用[9-11]；通过激活类胆碱通路参与镇痛作用[12-14]。但效果不够理想，患者常处于镇痛不全的状态，并且同时伴有不同程度的眩晕、行走不稳、嗜睡、疲劳感等不良反应[15]。曲马多是中枢性镇痛药，可以选择性地激动μ受体，有镇痛效果确切、成瘾性低、抗胆碱以及镇静不良反应小等优点[16]。但曲马多是中效镇痛药物，对症状较重的患者镇痛不完善，增大剂量虽可提高疗效，但随之增加的抗胆碱、镇静等不良反应使患者无法长期耐受。为了解决在DNP治疗上药物疗效和不良反应之间的矛盾，本研究通过将这两种药物联合应用治疗1型糖尿病大鼠神经病理性疼痛，观察不同浓度药物组合对DNP大鼠的镇痛效应，以及对DNP大鼠脊髓胶质细胞活化和炎症因子表达的影响，进一步探讨曲马多联合加巴喷丁治疗DNP的作用机制。

本研究选择6～7周龄、体重200～220 g的雄性SD大鼠作为研究对象。一是因为低龄和低体重的大鼠对于伤害性刺激较敏感，二是因为雄性大鼠相对于雌性大鼠在疼痛行为学监测方面不受雌激素周期影响。

本研究中，DNP模型痛阈检测结果显示，腹腔注射20 mg/kg曲马多对DNP大鼠机械缩足阈值无明显影响，给药后7 d热缩足潜伏期延长，而腹腔注射60 mg/kg加巴喷丁后可产生明显的镇痛效应，与汪一等[17]报道结果相似。20 mg/kg曲马多在单独应用时对糖尿病大鼠机械缩足阈值无明显影响，而在联合加巴喷丁后则可产生明显的镇痛效应。与60 mg/kg加巴喷丁组比较，联合曲马多后在第7天、第11天时机械缩足阈值升高，热缩足潜伏期延长，提示小剂量曲马多和加巴喷丁联合应用后，能够有效减轻糖尿病神经病理性大鼠的痛觉过敏，使加巴喷丁的有效镇痛时间延长，联合用药后10 mg/kg曲马多同样出现镇痛效果。

近年来，大量研究表明，脊髓小胶质细胞在DNP的发生发展过程中起着关键作用[18-19]，而小胶质细胞是炎症因子TNF-α、IL-1的主要来源[20]。本研究结果表明，与生理盐水组比较，各组大鼠脊髓内星状胶质细胞和小胶质细胞活化水平降低，脊髓TNF-α、IL-1的表达降低。与60 mg/kg加巴喷丁组比较，联合用药组大鼠脊髓内星状胶质细胞和小胶质细胞活化水平以及脊髓TNF-α、IL-1的表达降低更明显。提示曲马多复合加巴喷丁可以抑制脊髓胶质细胞激活，减少炎症因子释放，从而缓解糖尿病神经病理学疼痛的发生，但是具体通过何种通路影响脊髓胶质细胞及炎症因子的表达，还有待于进一步研究。

综上所述，曲马多复合加巴喷丁的镇痛效果优于单独应用曲马多或加巴喷丁，其机制可能与抑制胶质细胞的活化，并减少TNF-α、IL-1的表达有关。