壳聚糖浸泡对黄豆芽生长和主要生物活性物质含量的影响

吕霞敏，杨 睿，蒋 誉，黄建颖，董丽娟*

（浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江 杭州 310018）

黄豆是全球性农作物，具有产量高和营养丰富等特点[1]，经研究证明，豆芽的营养价值高于未发芽黄豆，其子叶含有丰富的蛋白质、脂肪、淀粉、无机盐和维生素等[2]。植酸和多酚是黄豆中的抗营养化合物，超出一定含量范围会降低黄豆的营养价值和蛋白质消化率[3]，通过发芽可以减轻抗营养化合物的影响，提高消化率[4-5]，增加营养成分含量，如增加L-抗坏血酸[6]、酚[7]、大豆异黄酮含量[8]。豆芽中含有蛋白质、矿物质、VC、纤维素、氨基酸等多种营养成分[9]，是一种天然的健康食品[10]，也可以作为促进健康的膳食补充剂[11]。但是一些加工者在豆芽生产过程中会使用一些添加剂来促进豆芽生长，这可能会危害到食用者的健康。为了改善这一问题，需要找到更多新的、有效的、可操作的提高豆芽产量与营养价值的培育方法。

壳聚糖（β-1,4-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖）化学名为脱乙酰几丁质，是通过甲壳素脱乙酰基制得的低聚糖，主要从虾蟹等甲壳类动物的外骨骼以及某些真菌的细胞壁中提取[12-14]。壳聚糖结构分子单元中大量的氨基和羟基为各种化学修饰提供了可能[15]，其所带的正电荷还赋予了它很多独有的生物、生理学特性，近年来被广泛应用于美容、环境、农业、药品和食品等行业。国外已有相关研究表明，壳聚糖用于豆芽生产，不仅可以提高产量，而且可以提高豆芽产品的品质，减少腐烂的发生[16]。究其原因，可能是壳聚糖的成膜性可在大豆表面形成具有微孔道的生物活性膜，从而影响呼吸作用。有研究证明，壳聚糖能够显著增强种子萌发时的呼吸速率，并随其含量的增加作用增强，加速种子内的物质转化，进而促进种子萌发生长[17]。但是目前针对壳聚糖处理对黄豆萌发期间生物活性物质含量的影响还鲜见报道。因此，本实验以不同质量浓度的壳聚糖浸泡处理黄豆再培养成豆芽，研究壳聚糖浸泡处理对黄豆芽生长及所含生物活性成分的影响作用，以期将壳聚糖浸泡处理开发为一种有效、快速、健康的促进豆芽成为优质功能性食品的新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄豆（‘牡丹圆粒91’） 黑龙江大用农业发展有限公司；水溶性壳聚糖（脱乙酰度为96.1%、黏度为20.0 mPa·s） 宁波海鑫生物制品有限公司；大豆苷、染料木素、大豆黄素、染料木黄酮、黄豆黄素、抗坏血酸、没食子酸、槲皮素（标准品），乙腈、磷酸、甲醇和乙酸（色谱纯） 美国Sigma-Aldrich公司；植酸（标准品） 上海阿拉丁工业公司；福林-酚合肥博美生物科技有限责任公司；201×8型阴离子交换树脂 上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

DYJ-A01自动豆芽机 中山荣威电器有限公司；LABCONCO冷冻干燥机 上海照生有限公司；QL-861漩涡振荡仪 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；3-30K高速台式冷冻离心机 德国Sigma公司；UV-2550紫外-可见分光光度计 日本Shimadzu公司；1100型高效液相色谱仪、1260型高效液相色谱仪、1200-6210型高效液相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黄豆芽的培养

根据预实验结果，选用0.2、0.4 g/100 mL和0.8 g/100 mL的壳聚糖溶液对黄豆进行浸泡处理，并测得各溶液的pH值分别为3.75、3.71和3.62。挑选的黄豆用蒸馏水清洗3 次，室温（（20±4）℃）下按照1∶4（m/V）比例分别于不同质量浓度壳聚糖溶液和蒸馏水（对照）中浸泡12 h。将浸泡好的黄豆平铺于豆芽机中，以蒸馏水作为培养液，在25 ℃避光条件下恒温培养（相对湿度90%），豆芽机每1 h自动循环喷洒蒸馏水2 min，每隔24 h更换一次培养液。

1.3.2 样品的制备

培养期间，每天于豆芽机中进行随机取样，30 根黄豆芽为一组样品，各设置3 个平行。取一部分豆芽立即液氮冷冻后于－80 ℃低温保存；另一部分首先测定下胚轴长度和鲜质量，然后立即置于－80 ℃冷冻保存，再于冷冻干燥机中（－50 ℃）冷冻干燥30 h。冷冻干燥的豆芽样品粉碎后过60 目筛，于－80 ℃冰箱密封保存备用。未发芽黄豆也经冷冻干燥、粉碎处理后于－80 ℃冰箱密封保存备用。

1.3.3 黄豆芽下胚轴长度和鲜质量的测定

使用软尺测量每组样品中每根豆芽的下胚轴长度，测量范围为胚轴顶端到胚根长出处，求平均值；鲜质量使用称量天平测量，求平均值。

1.3.4 黄豆芽中生物活性物质含量的测定

总抗坏血酸含量：参照Yun Juan等[18]的方法，取3.0 g黄豆芽样品，加0.2%（质量分数，下同）的偏磷酸溶液冰浴研磨并定容至25 mL。静置后于4 ℃、10 000×g离心15 min，取上清液，加入偏磷酸溶液定容至25 mL。取等体积的样品溶液与20 mg/mL二硫苏糖醇溶液混合，暗处反应30 min，待进样测定。精确称取25.0 mg抗坏血酸标准品，0.2%偏磷酸溶液溶解并定容至25 mL，分别取0.025、0.05、0.1、0.2 mL和0.4 mL溶液用偏磷酸溶液定容至25 mL作为标准溶液；取等体积的标准溶液与20 mg/mL的二硫苏糖醇溶液充分混合，暗处反应30 min。以抗坏血酸标准溶液的质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线y=22 257x－0.830 6，R2=0.999 9计算总抗坏血酸含量，以每千克黄豆芽中抗坏血酸的质量表示。

高效液相色谱条件：Venusil MP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为0.005 mol/L KH2PO4溶液（pH 2.65）、流动相B为甲醇；紫外检测器检测波长254 nm；柱温30 ℃；流速0.5 mL/min；进样量5 μL。

总酚含量：参照Pająk等[19]的方法，取0.5 g黄豆和冷冻干燥豆芽，分别加入5 mL无水甲醇搅拌30 min，于4 ℃、10 000×g离心20 min，收集上清液；再依次向沉淀物中加入5 mL和3 mL无水甲醇，相同条件离心，合并上清液，4 ℃保存备用。取0.75 mL样品提取液于25 mL容量瓶，加入5 mL蒸馏水和1 mL福林-酚试剂，反应5 min后加入3 mL 12%（质量分数，下同）的Na2CO3溶液，蒸馏水定容至25 mL。避光反应2 h，测定765 nm波长处紫外吸光度。准确称取0.1 g没食子酸标准品，蒸馏水定容至100 mL，分别取1、2、3、4、5 mL于25 mL容量瓶中，蒸馏水定容。以没食子酸质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线y=135.19x+0.008 8，R2=0.999 1计算总酚含量，结果表示为每克干样品相当于没食子酸的质量。

总黄酮含量：参照Guajardo-Flores等[20]的方法，取0.5 g样品，加入10 mL体积分数60%乙醇溶液搅拌提取1 h，70 ℃、100 Hz/min超声提取1 h，于4 000×g离心12 min，取0.6 mL提取液于25 mL容量瓶，加入0.5 mL 5%（质量分数，下同）NaNO2溶液，6 min后加入0.5 mL 10% Al(NO3)3溶液，反应6 min后加入4 mL 4% NaOH溶液，最后加体积分数60%乙醇溶液定容，静置15 min后测定357 nm波长处吸光度。准确称取2.0 mg槲皮素标准品，蒸馏水定容至10 mL，分别取0.3、0.6、0.9、1.2 mL和1.5 mL，加入0.5 mL 5% NaNO2溶液，6 min后加入0.5 mL质量分数10% Al(NO3)3溶液，6 min后加入4 mL 4% NaOH溶液，体积分数60%乙醇溶液定容至25 mL，15 min后测定357 nm波长处吸光度，以槲皮素作为标准品绘制标准曲线y=15.737x+0.674 9，R2=0.997 9，结果表示为每克干样品相当于槲皮素的质量。

植酸含量：参照Frühbeck等[21]的方法，分别称取0.5 g冷冻干燥黄豆粉和豆芽粉样品，加入10 mL 0.66 mol/L HCl溶液中搅拌提取2 h，沸水浴3 min，于12 000×g离心30 min，取1 mL上清液，蒸馏水定容至25 mL（调节pH值为6）；取10 mL该稀释提取液过阴离子交换柱，弃去收集液；15 mL蒸馏水淋洗，15 mL 0.1 mol/L NaCl溶液淋洗，弃去淋洗液；再用15 mL 0.7 mol/L NaCl溶液（调节pH值为3）洗脱并收集洗脱液。取10 μL 50%的植酸标准品定容于50 mL容量瓶，分别取1.6、0.8、0.4、0.2、0.025、0.0125 mL定容于10 mL容量瓶中。各取3 mL标准溶液与1 mL FeCl3-磺基水杨酸试剂混合均匀，室温下反应15 min，于500 nm波长处测定吸光度。根据标准曲线y=2.884 1x+0.890 1，R2=0.999 2计算植酸含量，结果以mg/g表示。

1.4 数据处理与分析

实验中每个样品平行测量3 次，采用Excel 2010软件统计分析数据，采用Origin 8.0软件作图，数据结果表示为的形式，使用Fisher检验的最小显著极差法对数据进行显著性分析，设置其显著性水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 黄豆芽下胚轴长度与鲜质量分析

图1 不同处理条件下黄豆芽的下胚轴长度（A）和鲜质量（B）变化Fig. 1 Changes in hypocotyl length (A) and fresh mass (B) of soybean sprouts under different treatments

如图1所示，相比对照组，各质量浓度壳聚糖处理的豆芽下胚轴长度均有所增加（P＜0.05）。培养2 d时，质量浓度为0.2、0.4 g/100 mL和0.8 g/100 mL的壳聚糖处理相对于对照组的增长率分别为10.48%、9.44%和7.64%；培养3 d时，增长率分别为19.88%、22.49%和35.39%；培养4 d时，增长率分别为24.0%、23.38%和26.01%。壳聚糖浸泡处理对黄豆芽鲜质量的影响与其对下胚轴长度的影响趋势类似。与对照相比，各质量浓度壳聚糖溶液使豆芽的鲜质量增加显著（P＜0.05），培养至5 d时，质量浓度为0.2、0.4 g/100 mL和0.8 g/100 mL壳聚糖溶液组相对于对照组鲜质量增长率分别为5.03%、12.89%和9.59%。其中，黄豆芽的下胚轴长度和鲜质量均在质量浓度0.4 g/100 mL壳聚糖处理并且培养5 d时达到最大值，结果表明壳聚糖浸泡处理对黄豆芽的下胚轴长度和鲜质量有显著的正向影响。这说明一定质量浓度范围内的壳聚糖作为外部诱导剂可促进黄豆芽的生长，且这与Mendoza-Sánchez[22]以及Pichyangkura[23]等的研究中证实壳聚糖可刺激植物生长的结论相一致。豆芽经过某些方式处理后，其生长过程中的一些代谢过程可能发生变化，例如植物组织或细胞的内源性激素平衡被改变，从而导致了芽长和根长的变化[20]。

2.2 黄豆芽生物活性成分含量的分析

2.2.1 总抗坏血酸含量分析

图2 不同处理和培养时间对黄豆芽总抗坏血酸含量的影响Fig. 2 Effects of different treatments and germination time on total ascorbic acid content of soybean sprouts

如图2所示，当壳聚糖溶液质量浓度为0.2 g/100 mL时，培养3 d的黄豆芽中总抗坏血酸含量（62.25 mg/kg）减少最为显著（P＜0.05），相对于对照组（82.86 mg/kg）减少了29.39%，但培养5 d时，其总抗坏血酸含量（80.67 mg/kg）又上升至与对照组（81.52 mg/kg）相当的水平。黄豆芽培养2 d时，随着壳聚糖溶液质量浓度的升高，黄豆芽中总抗坏血酸的含量随之增加，但除了质量浓度为0.8 g/100 mL时总抗坏血酸含量（72.26 mg/kg）高于对照组（69.65 mg/kg），其他各质量浓度处理豆芽中的总抗坏血酸含量均低于对照组；培养3～5 d，总抗坏血酸含量呈先增后减的趋势，在培养4 d的豆芽中出现最大值。其中，处理质量浓度为0.4 g/100 mL、培养4 d时出现最大总抗坏血酸含量（93.23 mg/kg），并且与对照组含量（93.33 mg/kg）相当。而培养5 d后，与培养4 d相比，所有样品中的总抗坏血酸含量均下降，此时壳聚糖溶液质量浓度为0.2 g/100 mL处理的豆芽总抗坏血酸含量（76.32 mg/kg）高于其他质量浓度处理组，但略低于对照组（81.52 mg/kg）。实验发现在未发芽的黄豆中没有检测到抗坏血酸，但其在发芽过程中显著增加，浸泡和萌发后观察到的总抗坏血酸含量增加可能是在打破休眠后开始的反应，以保护下胚轴生长免受由环境因素触发的氧化反应，壳聚糖可能干扰总抗坏血酸生物合成酶，其作用机制复杂。Tommasi[24]和Xu Maojun[25]等指出，在黄豆芽的生长过程中，抗坏血酸生物合成途径最后一步所需的谷氨酸脱氢酶的活性显著提高，从而使得抗坏血酸的合成量增加，说明抗坏血酸在黄豆萌发过程中的积累是由于其生物合成酶被重新激活。但由本实验结果发现，壳聚糖可能具有一定的影响谷氨酸脱氢酶活性作用。

2.2.2 总酚含量分析

图3 不同处理和培养时间对黄豆芽总酚含量的影响Fig. 3 Effects of different treatments and germination time on total phenolic content of soybean sprout

如图3所示，发芽导致总酚含量发生显著变化，主要是由于内源酶的活化和种子在此过程中复杂的生化代谢[19,26-27]。培养3～5 d时，0.2 g/100 mL的壳聚糖处理的豆芽中总酚含量高于其他处理组，其中培养5 d时总酚含量达到最大值（5.12 mg/g），且培养4～5 d时的含量显著高于对照组含量（P＜0.05），增长率分别为10.14%和10.88%。在整个发芽过程中，0.8 g/100 mL的壳聚糖溶液处理使得黄豆芽总酚含量总体显著低于对照组。培养2～3 d时，壳聚糖溶液对豆芽中酚类物质的生成具有一定的抑制作用，整体上降低了豆芽中的总酚含量。待培养4～5 d时，壳聚糖溶液处理使得豆芽中总酚含量有所增加，且以质量浓度为0.2 g/100 mL的壳聚糖溶液促进作用最为明显。总酚含量的增加主要是因为发芽过程中内源酶的激活以及复杂的生化代谢，使得细胞壁周围的很多成分降解，游离态和结合态酚类化合物得到释放，促进了酚类物质的合成[28]。Mendoza-Sánchez等[22]报道，经浓度为3.3 μmol/L和7 μmol/L的壳聚糖溶液处理后，豆芽中有3 种酚酸物质的含量增加较为明显，说明壳聚糖可以促进豆芽中酚类物质的积累。许多种植物经壳聚糖处理后发生氧化反应，这导致植物防御酶被诱导生成，其中包括苯丙氨酸解氨酶，它是上述酚类化合物生物合成中的主要酶，能够使得酚类化合物积累[29]。过量的酚类化合物具有抗营养特性，不同质量浓度壳聚糖浸泡的发芽黄豆芽中总酚含量在2.97～5.12 mg/g之间，表明壳聚糖质量浓度的变化对总酚含量有较大的影响。

2.2.3 总黄酮含量分析

如图4所示，黄豆在发芽过程中黄豆芽中总黄酮含量不断增加，且随着壳聚糖处理质量浓度升高而增加，呈现质量浓度依赖性。未发芽黄豆中的总黄酮含量较低（0.03 mg/g）；待发芽后，质量浓度0.4 g/100 mL和0.8 g/100 mL的壳聚糖溶液处理的黄豆芽中总黄酮含量增加较为显著（P＜0.05），其中以质量浓度0.8 g/100 mL壳聚糖处理的促进作用最明显。培养5 d时，质量浓度0.4 g/100 mL和0.8 g/100 mL的壳聚糖溶液处理的黄豆芽总黄酮含量分别为0.51 mg/g和0.64 mg/g，相对于对照组增长率分别为39.61%和76.06%。而质量浓度为0.2 g/100 mL的壳聚糖处理的黄豆芽总黄酮含量明显低于其他处理组，且与未处理组最为相近。发芽过程中黄酮类化合物含量的增加也可能是由于大分子质量多酚（如鞣酸）参与黄酮类化合物生物合成酶的激活所致[30]。此外，壳聚糖浸泡处理使总黄酮含量整体上得以增加，且以质量浓度为0.8 g/100 mL的壳聚糖溶液促进总黄酮含量增长的作用最为明显。Guajardo-Flores等[20]针对豆类的研究发现，豆类种子中的总黄酮含量随着其发芽而增加，本实验的结果与之相符合。

图4 壳聚糖浸泡处理对黄豆芽中总黄酮含量的影响Fig. 4 Effect of chitosan on total flavonoid content of soybean sprouts

2.2.4 植酸含量分析

图5 培养时间对黄豆芽中植酸含量的影响Fig. 5 Effects of different treatments and germination time on phytic acid content of soybean sprouts

如图5所示，定量结果表明未发芽黄豆的植酸含量为7.40 mg/g。随着培养时间延长，特别是在高质量浓度的壳聚糖溶液组中观察到植酸含量明显降低。值得注意的是，0.4 g/100 mL壳聚糖处理时，植酸含量始终与对照组含量相当；培养5 d时，与未萌发黄豆相比，植酸含量降低70.81%～78.92%；培养5 d时，0.8 g/100 mL壳聚糖处理的豆芽中植酸含量最低（1.56 mg/g，与黄豆相比降低78.92%）。Mendoza-Sánchez等[22]发现，菜豆发芽过程中植酸含量相比原始的种子减少了36%，而在经过不同浓度（3.3 μmol/L和7 μmol/L）的壳聚糖溶液浸泡处理后，豆芽中植酸的含量减少得更多，且质量浓度越高的壳聚糖溶液表现出的降低效果越明显。Wang Xinkun等[31]也报道培养豆芽时补充适宜质量浓度的Ca2+可以明显降低生长过程中所含植酸的含量，因为Ca2+可以提高植酸酶的活性，促进植酸分解成无机磷。在发芽过程中，植酸化合物因为植酸酶的分解作用以及作为能量来源而减少；在额外的环境刺激存在时，更高的能源需求使得植酸更迅速地分解。壳聚糖浸泡可降低黄豆芽中植酸的含量，说明壳聚糖浸泡也有可能提高了黄豆发芽过程中的植酸酶活性，促进了植酸的分解作用。

3 结 论

目前，已有关于不同质量浓度及不同脱乙酰度的壳聚糖[32-33]或壳聚糖衍生物[34]对豆芽生长的研究，但仅限于对豆芽的产率、茎长、茎粗、须根数、硬度、水分含量等方面的影响。针对壳聚糖处理对黄豆萌发期间生物活性物质含量的作用尚鲜见报道。本研究采用分光光度法和高效液相色谱法探究不同质量浓度壳聚糖处理对黄豆芽生长和主要生物活性物质含量的影响，以期能对相关研究方法进行拓展丰富。本实验结果表明，一定质量浓度范围内的壳聚糖作为外部诱导剂可促进黄豆芽的生长，黄豆芽生长过程中的壳聚糖对黄豆芽鲜质量的影响与下胚轴长度相似，说明壳聚糖处理可使得黄豆芽的产量增加，其影响不仅仅表现于豆芽形态上的变化，也应该表现于豆芽中化学成分含量的变化。此外，壳聚糖浸泡处理也会对黄豆芽中的主要生物活性物质含量产生一定影响。壳聚糖浸泡处理可以考虑作为一种生产低成本功能性食品的替代技术，壳聚糖的剂量是关键。本实验只研究了不同质量浓度壳聚糖处理对于黄豆芽生长与生物活性物质的影响，若进一步探究壳聚糖对果蔬的作用机理，将为壳聚糖更广泛的应用提供依据。