三亚临春岭森林公园土壤细菌群落多样性

(三亚学院翟明国院士工作站， 海南三亚572000)

0 引言

景区开发建设及游客踩踏等人为活动的频繁干扰会对景区内环境造成显著影响[1-3]，如景区开发及旅游活动会对旅游地植被、动物、土壤环境产生不同程度的影响[4-7]。土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，由于细菌群落结构复杂多样，传统研究方法难以全面分析其自然状态下的结构特征和多样性情况，近年来应用较广的Illumina高通量测序技术能够利用从土壤样本中直接获取的DNA构建文库并测序，在研究微生物群落结构方面优势明显。土壤细菌群落结构与土壤环境(如：养分、温度、水分等)关系密切，土壤利用方式改变会导致土壤细菌群落丰度和多样性相应变化。可以通过对比细菌群落结构及时了解土壤生态环境的变化进而及时调整土地利用方式、保护土壤生态环境。目前，针对旅游活动对土壤环境影响方面的研究还比较少，仅有的研究主要集中于对土壤环境的宏观影响方面，旅游活动对土壤微生物的影响研究较为缺乏[8-9]，旅游景区开发、游人踩踏等人为干扰对景区土壤微生物群落结构的影响尚不明确。

位于虎豹岭山脉的三亚临春岭森林公园于2013年1月开工建设，并于2014年9月正式建成开园，现在已经成为三亚市民和游客最主要的健身旅游活动场所之一。本研究选取临春岭森林公园为研究对象，调查分析不同程度的景区开发及人为干扰对土壤微生物生态环境的影响，以期从微生物结构和多样性的角度分析旅游干扰活动对土壤微生物的影响，为旅游景区合理开发利用提供科学依据。

1 研究区概况

三亚临春岭森林公园(109°31′40″E～109°32′07″E, 18°15′52″N～18°16′35″N)位于三亚市凤凰路临春岭路段北侧，北面与海螺农场相接, 山脉呈南北走向，园区占地面积187 hm2，海拔最高点约195.6 m，气候类型为热带海洋性气候，年均温为25.4 ℃，年均降雨量1 500 mm。土质类型主要为山地赤红壤，土壤质地较为黏重，山上森林覆盖率达65 %，主要由窿缘桉(Eucalytus exserta F.)、大叶相思(Acacia auriculiformis A.)及其他灌木构成的人工成熟林[10]。公园建成开园以来每天接待游客超千人，高峰期超5 000人，旅游干扰对景区土壤环境产生一定影响。

2 材料与方法

2.1 样品采集

临春岭森林公园主景区从登山平台到瞭望塔铺设宽2 m左右的石板路作为登山步道供游人行走，石板路两侧0～3 m定为游人干扰区，主要栽植低矮灌木和花卉，种植品种主要有蟛蜞菊(Wedeliachinensis(Osbeck.) Merr.)、朱瑾(Hibiscusrosa-sinensisLinn.)、九里香(MurrayaexoticaL.)、金凤花(Caesalpiniapulcherrima(L.) Sw.)、水鬼蕉(Hymenocallislittoralis(Jacq.) Salisb.)等；外围10～30 m是景观绿化区，以观赏树木火焰木(SpathodeacampanulataBeauv.)、翅荚决明(CassiaalataLinn.)等替代原有乔木树种方式进行人工绿化改造；最外围是人工成熟林区，以高大乔木窿缘桉和大叶相思为优势树种为主，其间分布低矮灌木。

本研究于2017年1月份沿登山步道自登山平台向上约200 m长的步道两侧随机取样，根据游人活动范围及景区开发建设情况，按照距离登山步道由近及远分为游人干扰区(L1)、景观绿化区(L2)、人工成熟林区(L3)，每个区域分别取样。其中，游人干扰区(L1)紧挨步道0～3 m[11-12]，主要以人工种植的灌木及花卉为主，游人干扰较明显；景观绿化区(L2)距步道10～30 m，主要以人工种植的观赏树木为主，游客有一定干扰影响；人工成熟林区(L3)距步道100～150 m，主要树种为窿缘桉及大叶相思。采用随机取样法，每个取样区分别随机选取10个采样点，去除表层枯枝落叶用土壤取样器挖取0～15 cm的上层土壤，土样分别充分混匀后过筛，按照“四分法”对样品缩分后分成两份，一份保存于-20 ℃冰箱并尽快完成细菌测序分析，另一份自然风干后测定土壤理化性质。

2.2 土壤理化性质的测定

土壤理化性质测定参考鲍士旦《土壤农化分析》[13]，土壤含水量采用烘干法，土壤容重采用环刀法，土壤pH采用酸度计法，土壤全碳采用重铬酸钾法，土壤全氮采用凯氏定氮法。

2.3 土壤总DNA的提取及rDNA PCR扩增

土壤总DNA提取利用土壤DNA提取试剂盒(Power Soil DNA Isolate Kit，美国mobio公司)，提取的总DNA用1.2 %的琼脂糖凝胶电泳检测提取质量。采用土壤细菌V3～V4区通用引物(336F: 5′-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′; 806R: 5′-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)扩增目的片段。PCR体系反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，45 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，25个循环；72 ℃延伸10 min。反应产物用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果，富集扩增产物，并切胶纯化[14]。

2.4 测序及数据分析处理

扩增产物送至广东南芯医疗科技有限公司进行MiSeq文库构建及Illumina测序。测序结果运用QIIME软件(Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0)去除过短序列、嵌合体等低质量序列，按97 %的序列相似度进行归并及OTUs (Operational taxonomic units)划分。采用Greengenes数据库进行序列比对获取门分类水平分布情况。利用R 3.1.2软件计算各样本(组)共有OTU的数量，并通过Venn图直观地呈现各样本(组)共有和独有OTU所占比例。

3 结果与分析

3.1 土壤理化特性分析

本次调查对比了三个区域土壤理化指标，L1区土壤含水量最高，L2居中，L3含水量最低，可能是由于取样时间正值三亚的旱季，降水不足导致自然成熟林区土壤含水量较低，而游人干扰区和景观绿化区种植了大量人工花卉和绿化树种人工灌溉频繁，因此土壤含水量较高；由于受到游人践踏的影响L1区的土壤容重明显高于其他区域；人工种植的花卉、观赏树木能获得定期人工补充肥料可能是L1区的全氮、全磷含量显著高于其他区域的原因；而碳氮比三个区域没有显著差异。具体见表1。

表1 不同取样点土壤理化性质差异Tab.1 Chemical properties of soil in three regions

3.2 测序文库评价

通过Hiseq高通量测序技术对三个取样地的土壤细菌16s rRNA的V3～V4区测序，经过序列质量优化控制后，三个取样地共获得134 713条序列，L1、L2、L3分别得到45 941、42 876、45 896条序列，三个取样点的土壤测序文库基本达饱和，图1显示三个样地的稀释性曲线均趋于平坦，说明测序数据合理。

3.3 土壤细菌群落的韦恩图分析

如图2所示，三个区域的OTU数一共为1 936个。L3区的OTU数目最多为1 195个，L1和L2区域的OTU数目接近，分别为955和923个；其中，L1区独有OTU数为348个，L2区独有OTU数为318个，L3区独有OTU数为557个；三个样地的共有OTU数目为424个，约占OTU总数的21.9 %。由此可知，较少被扰动的人工成熟林区土壤细菌OTU数量更丰富，而行道旁游人干扰区和景观绿化种植区的土壤微生物丰度略有降低。

图1 三个土壤样品的稀释曲线
Fig.1 Rarefaction curves of three soil samples

图2 三个区域土壤细菌OUT数量的Venn图
Fig.2 Venn diagram of OTU number in three regions

3.4 土壤细菌群落结构分析

临春岭森林公园三个区域的土壤共检测到13个细菌门，三个区域共有的细菌门类为：Proteobacteria变形菌门、Actinobacteria放线菌门、Acidobacteria酸杆菌门、Chloroflexi绿弯菌门、Firmicutes厚壁菌门、Planctomycetes浮霉菌门、Bacteroidetes拟杆菌门、Nitrospirae硝化螺菌门、Verrucomicrobia疣微菌门、Gemmatimonadetes芽单胞菌门。其中，Proteobacteria变形菌门占有绝对优势，特别是L1区和L2区分别占到96.7 %和96.5 %。其中的Latescibacteria和Cyanobacteria(蓝细菌)两个细菌门类为L1区特有；armatimonadetes为L2区特有。贺晓凌等[15]在研究中发现Latescibacteria是近垃圾池的土壤中特有的门类，并认为此微生物门类或许与垃圾降解相关。Latescibacteria在本研究中为L1区特有门类，或许进一步显示此细菌门类与人类活动关系密切。

3.5 土壤细菌相似度聚类分析

基于Unweighted UniFrac距离对三个样本进行聚类分析(图4)，结果显示，L1和L2高度相似，可聚为一类，说明L1和L2细菌群落趋同性更高，而L3则距离相对较远。表明旅游干扰区及人工绿化区的土壤细菌群落结构更相似。

图3 三个区域土壤细菌门组成
Fig.3 Relative abundances of bacterialphyla in three regions

图4 三个区域土壤细菌群落相似性分析
Fig.4 Similarity of bacterial communitystructure between three regions

3.6 土壤细菌的结构差异分析

图5 三个区域土壤OTU主成分分析Fig.5 Principal component analysis of OTU in three regions

对三个区域的土壤细菌进行了PCA分析，由图5知第一主轴的贡献率达到94.83 %，占绝对优势；第二主轴的贡献率仅为5.17 %。L1与L2在第一主轴上最为接近，表明相似度更高，而L3与另两个区域土壤的细菌群落结构差异更大。

4 讨论

土壤细菌占土壤微生物总量的70 %～90 %，对土壤的物质循环发挥着关键作用，土壤利用方式的改变会导致土壤细菌类群的结构和多样性发生变化。旅游开发改变了土地利用方式，此外游人践踏等旅游活动的干扰增加土壤的压力、加剧土地磨损，不仅会降低该地区动植物的数量和多样性，也对土壤微生物群落产生显著影响。李会琳等[16]研究发现森林土壤变更为茶园土壤后，菌群多样性指数以及菌群OTUs都显著降低。刘光荣[17]研究发现庐山景区原始森林区土壤微生物群落代谢活性最强，而旅游干扰大的区域土壤微生物群落结构不稳定，代谢活性减弱。段青倩等[18]证实旅游活动会显著降低五台山山地草甸土壤物质循环和转化能力，并进一步影响五台山草甸植被的多样性及生态系统的稳定性。旅游活动对张家界森林公园的土壤生态环境产生了显著影响，其中，细菌、真菌、放线菌的数量与旅游活动干扰强度显著相关，随着旅游活动干扰强度增大，微生物数量显著降低[19]。

本研究结果表明，土壤细菌的丰度和多样性整体表现为L3>L2>L1，成熟林区土壤微生物多样性最高，而人工林区和人工绿化区微生物更相近，与前人的相关研究结论一致，进一步证明人工景观绿化及游人干扰会对土壤微生物产生一定影响。本次研究结果显示三个区域土壤微生物种类中变形菌门(Proteobacteria)均占有绝对优势，变形菌门中包括了大量参与土壤氮、磷、硫和有机物代谢循环相关的细菌种类。刘洋等[20]通过454 高通量测序研究黄土高原不同乔木林土壤细菌群落，结果显示4 种乔木林下变形菌门(Proteobacteria)是最主要的优势菌门。

研究结果中变形菌门占绝对优势，其他细菌门类占比相对较小或许与临春岭优势树种窿缘桉有关，窿缘桉根系分泌物及凋落物会对林区土壤细菌的多样性产生影响[21-22]，其释放的某些化学物质会抑制林内其他植物的生长进而导致林区内群落结构简单[23]。研究结果也表明三个区域发现的个别门类为某个区域特有，如Latescibacteria为L1区独有，L1区距离步道最近，最易受到游人踩踏等影响，其土壤容重显著高于其他区域，同时人工养护也造成靠近步道的区域土壤水分和养分含量较高，可能会对土壤微生物群落结构产生影响，这或许表明此细菌门类与人类活动关系密切[15]。研究结果进一步证明旅游活动及人工绿化改造会对土壤微生物种群产生一定影响。

5 结论

①利用Illumina高通量测序技术对三亚临春岭森林公园三个区域土壤的细菌多样性进行检测，结果显示，三个区域共获得1936个OTU，分属于20个门，此外还有部分未分类细菌。景区土壤细菌群落多样性表现为：人工成熟林区>景观绿化区>游人干扰区。

②变形菌门(Proteobacteria)是土壤细菌群落中相对丰度最高的门类，在土壤细菌类群中占绝对优势。细菌门类相对单一或许与橼隆桉的化感作用相关。