载三氧化二砷PLGA微球的制备与体外释放对肝癌的影响

吴育民 杜端明 陈娟萍 刘春霖

三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)是中药砒霜的主要有效成分[1]。最早是治疗疟疾、结核病和梅毒的辅助药物，后来被用于治疗急性早幼粒白血病，取得了一定的疗效，接着发现三氧化二砷对肝癌和肺癌等肿瘤也有一定的抑制作用，并开发了三氧化二砷注射液用于临床治疗[2-4]。三氧化二砷能够影响细胞周期，抑制肿瘤细胞增殖与迁移，还能够诱导肿瘤细胞凋亡，可能通过下调Bcl-2/bax 基因的表达，使线粒体膜PT 通道开放，释放Cyto-C、AIF、钙离子等凋亡激发因子使细胞走向凋亡[5-7]。有研究发现，三氧化二砷能促进肿瘤血管内皮细胞的凋亡，干扰内皮细胞和肿瘤细胞之间的相互作用，从而诱导内皮细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成，间接抑制肿瘤生长[8-10]。

三氧化二砷虽然能够抑制肿瘤生长，但也存在许多问题。首先是毒副作用，三氧化二砷在杀灭肿瘤细胞的同时对正常细胞损伤较大，具有较强的毒性，其次三氧化二砷水溶性较小，给药时容易析出。因此有必要改进药物给药方式，构建药物载体，更好地更高效低毒地进行药物控制给药。乳酸/羟基乙酸共聚物(polylactic-co-glyconlic acid，PLGA)由乳酸和羟基乙酸缩合而成，可经人体正常代谢，最终降解为H2O和CO2，因此几乎对生物体无毒副作用[11]，具有良好的生物相容性和可降解性，可应用于药物载体研究，该微球体系对包埋的药物具有保护作用，并能够靶向到到某些特殊，控制药物释放，延长药物作用时间，降低药物毒性和刺激性等优点[12-13]。因此本研究摸索了PLGA微球的制备方法，并将As2O3成功包埋在PLGA 微球里，并进行相关表征，模拟体内环境控制释放As2O3，为进一步的载As2O3PLGA 微球体内实验打下基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

试剂。PLGA：aladdin P133293；三氧化二砷：北京双鹭药业； 20170701；PVA：aladdin P105126；二氯甲烷：AR 500 ml；PBS：Solarbio 20171211。

仪器。冷冻干燥机：上海比朗 FD-1A-50；旋转蒸发仪：山东博科RE-501；匀浆机：新芝 S10；恒温水浴锅：郑州宏朗 HH-2；药品冷藏柜：欧宝科技 SF-477S；温控摇床：太仓THZ-98；电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)：美国PE公司optima 8000；激光粒度仪：马尔文Zetasizer nano zs90。

1.2 载As2O3的 PLGA 微球制备

采用复乳溶剂蒸发法，将200 mg PLGA溶解在10 ml二氯甲烷溶液中，将 10 mg As2O3加入上述溶液中，用手持式匀浆机在5 000 rpm高速搅拌10 s，形成初乳溶液；迅速将初乳溶液倒入10 ml 3% PVA中，冰浴下10000 rpm匀浆搅拌10 s，形成复乳溶液;将复乳溶液倒入500 ml 0.5% PVA中，室温下磁力搅拌2 h,减压蒸馏6 h去除其中残余的有机溶剂，5 000 rpm离心15 min,去离子水洗3次，将沉淀冷冻干燥可得到 PLGA 微球载As2O3，4 ℃保存。

采用同样的方法制备不加药物的空白 PLGA 微球粉末。

1.3 载As2O3的PLGA粒径测定

称取一定量载As2O3的PLGA微球(或空白PLGA微球)溶于含0.5% Tween 80的水中使得浓度为1 mg/ml，超声分散10 min后立即用激光粒度仪测定粒径。

1.4 载As2O3的PLGA 微球体外释放

取制备好的载As2O3的PLGA微球溶于3 ml PBS中溶解混匀混匀，37 ℃条件下，200 rpm震荡培养，每隔24 h取样，3 000 r/min离心5 min取上清与4 ℃保存，并补液3 ml继续培养，连续19天取样。连续取样完成后，利用ICP-MS测定砷含量换算成As2O3的含量，绘制释放曲线。

1.5 兔肝癌模型造模

VX2 细胞培养:从液氮中取出冻存管、用PE手套包裹后用镊子迅速将其置于38 ℃～40 ℃温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1 min之内融化,打开冻存管，迅速将细胞悬液吸到已经装有10 ml特定培养基的离心管中，混匀将细胞转移至培养瓶中，37 ℃培养，第二天观察生长情况，换液继续培养。弃去培养上清，PBS洗两遍，0.25%胰酶(含0.02% EDTA)消化3 min，加入DMEM高糖培养基终止消化并悬起细胞；收集细胞至离心管中，1 000 rpm离心3 min，弃尽上清，加入 DMEM 高糖培养基吸管吹匀；将上述细胞悬液稀释至适宜细胞密度后加入准备好的培养皿中，于37 ℃ 5%二氧化碳培养箱中培养。

肿瘤细胞接种:收集生长状态良好的VX2细胞，消化悬浮后接种在新西兰兔右侧后腿，1～2周后基本形成肿瘤，之后后进行肝癌模型造模。

兔肝癌模型建立:将成瘤后新西兰兔的肿瘤取下，裁剪成2～3 mm3大小瘤粒。麻醉移植兔子，剑突下约2 cm开口，将肝脏暴露在视野下，用显微镊子夹起瘤块，包埋在肝脏中，深约1 cm，待肝脏无瘤粒溜出、无出血，关闭腹腔，缝合。

2 结果

2.1 载As2O3的PLGA微球制备

载As2O3的 PLGA 微球以及空载的PLGA微球扫描电镜图片，都是均匀的圆球状，大小均匀，形状规则稳定。空载的PLGA微球更加的光滑，载 As2O3的 PLGA 微球表面较为粗糙，有的还有部分凹陷，但更为均一。

2.2 载As2O3 的PLGA微球粒径测定

如下图1所示，两种微球粒径的比较，可以观察到粒径差距不大，主要均分布在20～30 μm之间，说明包埋 As2O3之后的PLGA微球几乎不受影响，与空载微球相差无异。显示了PLGA微球良好的稳定性和优异的药物包埋能力。

2.3 载 As2O3 的PLGA 微球体外释放

图2显示的是载 As2O3的PLGA 微球体外释放的累计释放曲线，随着时间进行 As2O3缓慢均匀的从 PLGA 中释放出来，逐渐增多。由图2可以看出一开始释放速率较快，随后逐渐减缓直至释放完全。载As2O3PLGA微球体外释放在15天趋近于释放完全。

3 讨论

三氧化二砷拥有良好的抗肿瘤效果，广泛地应用于各种实体瘤及白血病的治疗，但由于其水溶性和毒副作用限制了其更加广泛和高效率的应用。本实验采用PLGA微球作为药物载体进行包埋As2O3，制备成载As2O3的 PLGA 微球制剂，实现药物的控制释放，降低As2O3的毒性，提高As2O3的利用率。

首先，我们通过优化工艺改善制备条件，采用复乳溶剂蒸发法制备了均一稳定的PLGA微球，并通过在制备微球过程中加入了As2O3，实现了包埋As2O3的PLGA微球的制备，扫描电镜分析载As2O3的PLGA微球与空载的PLGA微球相比，差别不大，只是略微的微球表面粗糙，个别微球表面凹陷，宏观观察呈白色粉末(空载PLGA也呈白色粉末状)，表明As2O3已经被包埋进去。激光粒度仪对空载和载 As2O3的PLGA微球进行表征，粒径大部分集中在20～30 μm之间，并没有因为 As2O3而改变，说明了PLGA良好的药物包埋能力和稳定的结构。

图1 PLGA微球粒径测定

图2 载As2O3 PLGA微球体外释放曲线

进一步模拟体内环境的As2O3药物缓释，在37 ℃条件下，200 rpm震荡培养，每天定时取样，连续19天不间断，采用ICP-MS检测As的含量，换算成As2O3的含量，从而可以算出As2O3每天的累计释放量，并绘制释放曲线。随着时间进行As2O3缓慢均匀的从PLGA中释放出来，逐渐增多。由图可以看出一开始释放速率较快，随后逐渐减缓直至释放完全。载As2O3PLGA微球体外释放在15天趋近于释放完全。相比于游离的药物，微球载药的控制释放极大地提高了As2O3的利用率，也减少了它的毒副作用。

对新西兰兔进行肝癌动物模型造模，首先是培养VX2细胞，之后接种新西兰兔成瘤，最后去肿瘤植入肝脏，肝癌模型造模。目前为止造模成功，下一步的研究将载As2O3PLGA微球用于肝癌的治疗中。

致力于开发新型的给药方式、新剂型一直是许多研究者关于如何利用As2O3的不懈追求，最大限度提高 As2O3的药物利用率，减少它的副作用，是我们研究者的最终目标[14-15]。我们提供的载As2O3PLGA微球在体外环境下显示了良好的药物缓释性能，为接下来的载As2O3的PLGA体内给药实验提供重要的支撑。