疏肝健脾饮对乳腺癌MCF-10AT细胞株生长抑制及凋亡的研究

王圆圆 刘晓菲 张 洋 韩 笑 李斐斐

近年来,全球乳腺癌发病率攀升,已位居女性恶性肿瘤发病率首位[1]。乳腺癌癌前病变(breast precancerous lesion)是癌变过程中必经环节,阻断和逆转其癌变是有效预防乳腺癌的关键。发挥中医药个体化治疗的优势，对乳腺癌的二级预防，降低其发病率具有重要意义。我们课题组前期研究中发现疏肝健脾方能够调节乳腺增生大鼠的性激素,降低VEGF和bFGF的表达，抑制增生腺体的血管形成，并通过降低乳腺组织的PCNA和Bcl-2的表达活性，增加bax表达，抑制乳腺组织细胞的增殖，促进细胞的凋亡[2]。因此本次课题旨在进一步研究中药疏肝健脾饮对乳腺癌MCF-10AT细胞增殖抑制及诱导凋亡的影响，探讨疏肝健脾饮对乳腺癌的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系与动物来源 细胞株：MCF-10AT细胞株(中国科学院上海生科院细胞资源中心有售)。药物：疏肝健脾饮由柴胡12 g、青皮12 g、茯苓15 g、薏苡仁30 g、莪术9 g组成。制剂：柴胡、青皮、莪术三味药材加入10倍量的水提取挥发油6 h，收集挥发油，另器保存备用；薏苡仁、茯苓与提取挥发油后的药渣加入12倍量水煎煮3次，每次1 h，煎液与提取挥发油后的药液合并，滤过，浓缩至1∶1.5(药材∶药液)，加入乙醇使含醇量达到60%，静置24 h，取上清液，沉淀部分离心，合并提取液，减压回收乙醇后，浓缩至相对密度1.18(60 ℃)备用。另将挥发油与吐温-80混匀，加入薏苡仁、茯苓等药物提取液中，混匀，再加入蔗糖，山梨酸，调节PH值并用水调整至浓度0.78 g/ml。采用上述水提醇沉法制备各拆方组，疏肝理气组(柴胡12 g、青皮12 g)，浓度0.24 g/ml；健脾化痰组(茯苓15 g、薏苡仁30 g)，浓度0.45 g/ml；活血化瘀组(莪术9 g)，浓度0.09 g/ml。他莫昔芬(TAM)制备：溶于生理盐水，浓度为0.03 mg/ml。(购于上海旭东海普药业)。

1.1.2 药物与试剂 胎牛血清(fetal bovine serum)、高糖DMEM细胞培养液，青霉素、链霉素(北京碧云天生物技术研究所)，DMSO、胰蛋白酶粉(Trypsin)、MTT(Amresco公司)。凋亡及周期检测试剂盒，Annexin V-FITC/PI试剂盒(北京大学人类疾病基因研究中心)。其余常规生化试剂均为国产分析纯。

实验分组细胞对照组:不加任何处理因素。

1.1.3 仪器 CO2培养箱(Heraeus公司产品)；MTT(Amresco公司)；FACSCalibur 流式细胞仪(美国BD公司产品)；凋亡及周期检测试剂盒，Annexin V-FITC/PI试剂盒(北京大学人类疾病基因研究中心)； ClassⅡ2085型超净工作台(美国Thermo Forma公司产品)，台式离心机(上海卢湘仪器);旋转蒸发仪(天津科诺仪器);电子调温电热套(天津市泰斯特仪器)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组 将120只裸鼠随机分成6组，每组20只，模型对照组、疏肝健脾饮组、疏肝理气组、健脾化痰组、活血化瘀组、他莫昔芬组。分别给予生理盐水、疏肝健脾饮及各拆方、他莫昔芬灌胃，每天1次，灌胃液体量均为0.4 ml/(天·只)，疏肝理气组浓度0.24 g/ml；健脾化痰组浓度0.45 g/ml；活血化瘀组浓度0.09 g/ml。他莫昔芬浓度为0.03 mg/ml，连续给药15天。末次给药2 h后经下腔静脉采血，离心后取血清-80 ℃冻存备用。实验用药时加入完全培养基使药物血清浓度为20%，4 ℃保存备用。

1.2.2 细胞的培养 用含 10%胎牛血清 100 U/ml庆大霉素的 DMEM/F-12培养液在37.5% CO2培养箱中孵育乳腺癌MCF-10AT细胞，每24 h换液传代，随机选取对数期生长的乳腺癌细胞株MCF-10AT细胞分成6份，CO2培养箱中孵育MCF-10AT细胞每24 h换液传代。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 乳腺癌细胞株MCF-10AT按每瓶10×104接种，5% CO2，37 ℃常规培养至贴壁，设模型对照组、疏肝健脾饮组、疏肝理气组、健脾化痰组、活血化瘀组、他莫昔芬组共6组，每组加入实验用药，继续培养72 h，分别收集旧培养基，PBS清洗，滴入胰酶消化，1 200 r/min离心6 min，收集各时间点细胞。将各组细胞经PBS 液漂洗2次，按Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒试剂盒操作，上流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期，每份标本计数10000个细胞，实验重复3次。

1.2.4 MTT比色法检测药物对细胞的抑制率 取对数生长期的乳腺癌细胞株 MCF-10AT按每孔4000个细胞/100 μl ，将细胞重悬，接种于96孔板，贴壁24 h，加入相同的培养液，将细胞培养24、48 和72 h后，每孔加入5 mg/ml MTT 液15 μl，继续孵育4 h后，弃去各孔原溶液加DMSO 150 μl，放于摇床上摇动10 min，使用多功能酶标仪测定波长570 nm下吸光度(A)，每组6个复孔，取其平均值计算细胞存活率。细胞抑制率=(对照组OD550-试验组OD550)/对照组OD550×100%。实验重复3 次。

1.3 统计学方法

2 结果

与模型对照组相比，疏肝健脾饮组、疏肝理气组、健脾化痰组、活血化瘀组、他莫昔芬组对MCF-10AT细胞具有明显抑制作用。且随着药物作用时间延长(24、48、72 h)，平均抑制率逐渐增高，呈现时间依赖效应，有显著性差异(P<0.05)(表1)。

分别在24 h、48 h、72 h测得各组抑制率之间差别均有统计学意义(F=63.208、21.716、36.457，P<0.05),各时间点抑制作用以他莫昔芬组最为显著，其次为疏肝健脾饮组、疏肝理气组，而健脾化痰组、疏肝理气活血化瘀组两组抑制作用较弱。他莫昔芬组抑制率在24 h已较为明显，随着作用时间延长，抑制率不断增加，中药各组在24～48 h抑制率增长幅度明显高于他莫昔芬组，48 h后疏肝健脾饮组与他莫昔芬组间抑制率无明显统计学差异(P=0.069)(表1)。

流式细胞仪检测细胞凋亡结果，将各组细胞分别利用流式细胞仪对细胞凋亡进行定量检测。结果显示，各处理组细胞凋亡率与空白对照组比较均显著增加，以他莫昔芬组增加最为明显，依次为疏肝健脾饮组、疏肝理气组、健脾化痰组(P<0.05)、活血化瘀组。疏肝健脾饮组与他莫昔芬组明显高于疏肝理气组、健脾化痰组和活血化瘀组(P=0.000)(表1)。

表1 各组对细胞株MCF-10AT的生长抑制及凋亡的影响

注：与模型对照组相比，*为P<0.05，与他莫昔芬组对比，△为P<0.05，与疏肝健脾饮组对比，▲为P<0.05。

3 讨论

《疡科心得集·辨乳癖乳痰乳岩论》中亦云“夫乳岩之起也,由于忧郁思虑积想在心,所愿不遂,脾气逆,以致经络痞塞,结聚成核”。说明情志不舒，肝气郁滞，横逆犯脾,脾失健运,清阳不升,浊阴不降,留于中焦,滞于膈间,生湿聚痰,结于乳络致乳络阻塞不通而变生乳岩。又因冲任之气血,上行为乳,下行为月水,若冲任失调,气血瘀滞,积聚于乳房胞宫,则乳痛或月事紊乱,气滞血瘀痰凝而导致乳内结块。裴晓华等还认为“毒瘀互结”证可以看作是乳腺癌癌前病变特有的阶段[3]。故根据以上病因病机的分析，对于乳腺癌的治疗应以疏肝理气、活血化瘀为基本原则。此前李湘奇等人也研究表明，以疏肝健脾为主要功效的乳康饮对人乳腺癌细胞MDA-MB-435S有明显的增殖抑制效应，而且能够诱导人乳腺癌细胞 MDA-MB-435S的凋亡[4]。本实验中柴胡的主要活性成分为柴胡皂苷，可多途径的调节基因促进细胞的凋亡[5]。青皮的成分被研究发现可通过影响VEGF-C诱导的淋巴管生成抑制乳腺癌淋巴结转移[6]。茯苓多糖为茯苓的主要活性成份,对小鼠Sarcoma180肿瘤细胞有杀伤和诱导凋亡的作用[7]。薏苡仁中的两种抗肿瘤活性成分薏苡仁多糖和薏苡仁油 具有较好的抗肿瘤作用[8]。莪术油可降低乳腺癌癌前病变模型大鼠的癌变发生率及死亡率,可在癌前病变阶段预防、逆转、阻断乳腺癌的发生发展[9]。并且莪术油能够降低DMBA(7,12-二甲基苯蒽)诱导大鼠乳腺癌癌前病变组织中上皮细胞的增殖活性，改善乳腺癌癌前病变造模大鼠的血液流变学,增加乳房的微循环灌注量,是其治疗和预防乳腺癌癌前病变的机理之一[10]。

乳腺癌的生成是肿瘤细胞增殖及凋亡平衡失调的结果：细胞周期失控导致细胞过度增殖,但更重要的是细胞凋亡受阻,直接导致了衰老、受损及异常细胞的生命延长[11]。因此,有效抑制乳腺癌细胞增殖并诱导其凋亡的同时降低其侵袭能力是防治乳腺癌的关键。本实验通过流式细胞术及MTT比色法检测细胞周期、细胞凋亡及肿瘤生长的情况，与模型对照组相比，各实验组中细胞的凋亡率及抑瘤率随时间的延长均有不同程度升高，其中疏肝健脾饮组、他莫昔芬组升高最明显，数据具有统计学差异(P<0.05)。在细胞增殖实验中，疏肝健脾饮组抑制细胞增殖的作用及起效时间均优于其他拆方组，而疏肝理气组作用要强于健脾化痰组及活血化瘀组，推测疏肝理气组中的中药成分对肿瘤抑制作用要偏强于健脾化痰组及活血化瘀组。本方中柴胡舒肝气，畅气血；青皮疏肝散结，二者共为君药；茯苓健脾补中，渗湿利水，与柴胡合用，行气以助行水，疏肝木而补脾土；薏苡仁甘补淡渗，功似茯苓，二药共为臣药，共奏化痰渗湿之功；莪术乃治积聚诸气最要之药，既能助柴胡行气以止痛，又能破血以逐瘀，为佐使药。诸药相合，疏肝同时健脾，理气不忘化瘀。各中药成分间有着相互促进作用，故其拆方的作用效果明显低于全方。

目前为止，他莫昔芬仍是绝经前ER阳性乳腺癌术后患者第一线抗雌激素药物。但它同时刺激ER阳性的子宫内膜细胞增生，使子宫内膜呈现出了息肉-增生-恶性变等多样的变化[12-13]。后期相应的治疗如反复刮宫等，给患者带来一系列的痛苦。因此，寻找与他莫昔芬疗效相当，毒副作用少的中药制剂，具有很大的潜力和发展前景。本实验研究表明疏肝健脾饮可以抑制乳腺癌细胞MCF-10AT的增殖，并促进其凋亡。由于各拆方中仍含有不等的有效成分，如何调整方剂组成及各药物用量使得疏肝健脾饮发挥最大疗效仍需进一步的实验论证，结果理想后有望将疏肝健脾饮应用于临床，为患者带来福音。