芡茎多糖单糖组成及抗炎活性

王 倩， 吴啟南，2*， 吴达维， 黄志恒， 薛 敏， 乔晶晶， 桑梦如

（1. 南京中医药大学药学院， 江苏 南京210023； 2. 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心， 江苏 南京210023）

植物多糖作为一类重要的天然大分子活性物质, 具有抗氧化[1-2]、 抗炎[3]、 抗病毒[4]、 抗肿瘤[5]、 降血糖[6-7]、降血脂[8]以及提高免疫[9]等广泛的生物活性, 多糖研究也成为当前天然产物研究最活跃的领域之一。

芡Euryale ferox Salisb 为睡莲科单属种水生植物, 有苏芡和刺芡2 个品种[10]。 芡茎是芡的叶柄和花梗又称鸡头菜, 嫩茎在夏秋季节常作为时令蔬菜食用[11]。 据《本草纲目》 记载, 芡茎有“止烦渴, 除虚热” 之功效[12]。 芡茎中丰富的氨基酸和膳食纤维为多糖的获得提供了丰富的原材料[13]。 通过芡实种植基地调研, 发现芡茎作为芡的非药用部位被丢弃, 造成了巨大的资源浪费, 而现代药理实验证明芡茎多糖具有良好的降糖、 调脂、 抗氧化等作用[14]。 但目前有关芡茎多糖的抗炎活性未见有相关报道, 因此, 本研究从废弃资源利用的角度出发, 首先对其进行回收, 其次对回收的芡茎通过干燥, 粉碎等前处理, 从中提取纯化多糖成分, 并利用高效液相色谱-蒸发光散射（HPLC-ELSD）、 高效液相凝胶色谱（HPGPC） 等方法对其多糖单糖组成、 分子量进行分析, 并对芡茎多糖（EFPP） 的抗炎活性进行初步探究, 以期为后续化妆品及食品的研发提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters e2695 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）； Alltech 6000 ELSD （美国Alltech 公司）； Hypersil NH2色谱柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm）； AY220 型电子分析天平（日本岛津公司）； SAGA-10TY 型易普易达超纯水仪（南京易普易达科技发展有限公司）； UV-1100 型紫外分光光度计 南京以马内利仪器设备有限公司； FreeZone2.5L型真空冷冻干燥机（美国Labconnco 公司）； BSZ-100 型自动部分收集器（上海青浦沪西仪器厂）； 其他试剂均为分析纯。

1.2 材料 DEAE 纤维素（上海宝曼生物科技有限公司）；L-鼠李糖、 D-木糖、 L-阿拉伯糖、 D-果糖、 D-甘露糖、 D-葡萄糖（上海源叶生物科技有限公司）； Dextran 标准葡聚糖（上海源叶生物科技有限公司）； 二甲苯（江苏永华精细化学品有限公司）； 小鼠白介素-1ß （IL-1ß）、 白细胞介素-6 （IL-6）、 肿瘤坏死因子-α （TNF-α） Elisa 试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司）。 芡茎2017 年9 月采集于江苏高邮界首, 经南京中医药大学吴啟南教授鉴定为睡莲科芡属芡Euryale ferox Salisb. 的叶柄和花梗。

2 方法与结果

2.1 芡茎多糖提取

2.1.1 原料预处理 将芡茎切3 ～5 cm 小段, 50 ℃烘干,粉碎过20 目筛。 称取500 g 芡茎粉末, 加10 倍量无水乙醇, 回流提取3 次, 每次2 h, 抽滤, 弃滤液, 滤渣挥干溶剂, 以除去芡茎中的有颜色物质、 小分子多糖、 低聚糖及小分子化合物, 得到预处理的芡茎粉末备用。

2.1.2 提取 精密称取预处理的芡茎粉末250 g, 加入10倍体积超纯水, 超声提取（40 kHz, 80 ℃） 32 min。 抽滤,滤液加无水乙醇使得含醇量为80%, 4 ℃过夜, 离心, 弃滤液, 无水乙醇洗涤3 次, 冷冻干燥, 即得[15]。

2.2 纯化 芡茎多糖采用优化后的木瓜蛋白酶结合三氯乙酸法[16]脱蛋白, 进行初步纯化。 取经脱蛋白处理后的芡茎多糖, 采用离子交换柱色谱进行分离纯化。 依次以蒸馏水和梯度NaCl 溶液为洗脱液, 体积流量0.5 mL/min, 流出液5 mL/管, 蒽酮-硫酸[17]法隔管跟踪检测, 在波长620 nm下测定吸光度, 收集同一洗脱峰的多糖样品, 以管号为横坐标, 多糖洗脱液的吸光度为纵坐标, 绘制洗脱曲线, 见图1。 按洗脱峰收集、 合并、 透析、 浓缩、 醇沉和冻干,处理得到纯化芡茎多糖3 个组分EFPP1、 EFPP2、 EFPP3,均为白色粉末, 其中EFPP1 洗脱液为蒸馏水, EFPP2 洗脱液为0.1 mol/L NaCl, EFPP3 洗脱液为0.2 mol/L NaCl。

图1 芡茎多糖DEAE-52 洗脱曲线

2.3 相对分子量测定

2.3.1 色谱条件 TSK-gel G5000 PWxl 色谱柱（7.8 mm×30 cm, 日本Tosoh 公司）； 流动相蒸馏水； 体积流量0.8 mL/min； 柱温30 ℃； 进样量10 μL。 蒸发光散射器的检测条件为漂移管温度110 ℃； 载气流量1.8 mL/min； 增益1[18-19]。

2.3.2 供试品溶液制备 分别取Dextran T5、 T10、 T40、T70、 T380、 T2000 等已知相对分子质量葡聚糖对照品, 以蒸馏水配成2 g/L 的溶液, 过0.45 μm 微孔滤膜, 在“2.3.1” 项色谱条件下进样。 以对照品分子量（Mw） 的对数与其相对应的保留时间（tR） 进行回归, 得回归方程log Mw= a+btR[20]。 分 别 取 芡 茎 多 糖 组 分EFPP1、 EFPP2、EFPP3 以蒸馏水配成质量浓度为2 g/L 的多糖溶液, 测得各组分相对分子质量。 见图2。

EFPP1 中有2 个明显峰, 保留时间分别为5.783、8.737 min； EFPP2 中也存在2 个明显峰, 保留时间分别为5.340、 6.668 min； EFPP3 不但多糖分子量太大且在制备过程中得率较低, 故主要对EFPP1 和EFPP2 进行研究。 以对照品分子量（Mw） 的对数与其相对应的保留时间（tR）进行回归, 得方程log Mw = -0.437 8 tR+9.117 9, r =0.999 0, 根据标准曲线可计算出EFPP1 组分中保留时间8.737, EFPP2 组分中保留时间6.668 min 下多糖相对分子量分别为1.96×102、 1.58×103KDa。 另外EFPP1、 EFPP2组分保留时间分别为5.783、 5.340 min, 多糖分子量均大于2.00×103KDa。

图2 各成分HPGPC 图

2.4 单糖组成分析

2.4.1 色谱条件 Hypersil NH2色谱柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）； 流动相乙腈-水（85 ∶15）； 体积流量0.8 mL/min；柱温30 ℃； 进样量10 μL。 蒸发光散射器的检测条件为漂移管温度110 ℃； 载气流量1.8 L/min； 增益1[21]。

2.4.2 混合单糖对照品及供试品溶液制备 精密称取单糖对照品各20 mg, 用蒸馏水配成4 g/L 的混合单糖对照品溶液, 再将其稀释成系列浓度对照品, 同时将每种单糖配成4 g/L的标准单糖对照品溶液。

分别取芡茎多糖EFPP1、 EFPP2 各10 mg, 加入到2 mL的安瓿瓶中, 向瓶中加入1.5 mL 2 mol/L H2SO4溶液, 铝盖压口封管, 将瓶置于105 ℃烘箱, 水解8 h, 冷却,BaCO3调pH 7, 12 000 r/min 离心10 min, 上清液过0.45 μm微孔滤膜备用。 分析结果见图3。

可知, EFPP1、 EFPP2 都含有4 种单糖, 出峰时间分别为鼠李糖、 阿拉伯糖、 甘露糖、 葡萄糖。 EFPP1 中4 种单糖其物质的量之比12.06 ∶9.544 ∶3.967 ∶9.131。 EFPP2中4 种单糖其物质的量之比13.69 ∶11.64 ∶18.14 ∶6.616。

2.4.3 方法学考察

2.4.3.1 线性关系考察 精密量取混合对照品适量, 用超纯水稀释成混合对照品系列溶液。 在“2.4.1” 项色谱条件下测定。 以单糖峰面积的对数为纵坐标（Y）, 对照品进样量的对数为横坐标（X）, 进行线性回归, 结果测得6 种单糖在各自范围内线性关系良好, 结果见表1。

表1 各成分线性关系

2.4.3.2 精密度试验 精密吸取一定浓度的混合对照品溶液, 在“2.4.1” 项色谱条件下连续进样6 次, 测得各单糖峰面积的RSD 1.04% ～1.92%, 表明仪器精密度良好。

2.4.3.3 重复性试验 精密称取芡茎多糖样品EFPP1 6份, 按“2.4.2” 项下方法制备供试品溶液, 在“2.4.1”项色谱条件下进样, 测得EFPP1 中各单糖峰面积RSD 1.02% ～2.78%, 表明该方法重复性良好。

2.4.3.4 稳定性试验 取芡茎多糖样品EFPP1 供试品溶液, 在“2.4.1” 项色谱条件下, 分别于0、 2、 4、 8、 12、24 h 进样, 测得EFPP1 中各单糖峰面积RSD 0.82% ～2.27%, 表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

图3 各成分HPLC-ELSD 图

2.4.3.5 加样回收率试验 称取已知含有量的同一批样品9 份, 精密称定, 加入样品中各单糖成分含有量80%、100%、 120%的对照品溶液, 按“2.4.2” 项下方法水解,在“2.4.1” 项色谱条件下进样, EFPP1 中各单糖平均加样回收率95.81% ～97.35%, RSD 1.26% ～2.43%, 结果见表2。

2.5 抗炎活性评价

2.5.1 分组与给药 ICR 小鼠36 只, 随机分为空白组、 模型组、 阳性组、 芡茎多糖高、 中、 低6 组。 每组6 只。 二甲苯致炎前, 每天上午9： 00 和下午4： 00 灌胃给药, 连续给药3 d。 阳性药组给予阿司匹林混悬液, 芡茎多糖高、中、 低剂量组分别给予不同质量浓度的芡茎多糖溶液, 空白组和模型组给予等体积的生理盐水, 各组小鼠每次给药体积为10 mL/kg。

2.5.2 芡茎多糖对耳肿胀度、 各炎症因子的影响 末次给药1 h 后, 除空白组外, 各组小鼠于右耳正反两面涂0.04 mL二甲苯致炎, 左耳作对照。 1 h 后眼眶取血, 血样静置30 min 后3 000 r/min 离心10 min, 取上清, ELISA 法检测血清中TNF-α、 IL-1ß、 IL-6 水平。 将取完血后小鼠脱颈椎处死, 沿耳廓线剪下两耳, 用直径7 mm 的打孔器在同一部位打下圆耳片, 称定质量, 以左右耳片质量之差与左耳的比值为肿胀度。 结果见表3。

表2 各成分加样回收率试验结果（n=9）

表3 芡茎多糖对小鼠耳廓肿胀度以及血清中TNF-α， IL-1ß， IL-6 水平的影响， n=6）

表3 芡茎多糖对小鼠耳廓肿胀度以及血清中TNF-α， IL-1ß， IL-6 水平的影响， n=6）

注：与空白组比较,aP＜0.01；与模型组比较,bP＜0.01,cP＜0.05

images/BZ_234_236_2458_2244_2508.png空白组 - 0b 250.30±22.89b 35.61±4.76b 63.20±4.74b模型组 - 0.55±0.30a 351.19±8.57a 51.48±0.91a,b 82.49±1.56a,c阳性组 0.06 0.06±0.02c 272.83±15.69b 36.79±3.62b 64.56±5.85c芡茎多糖高剂量组 0.4 0.10±0.37c 280.92±19.77b 36.58±6.64b 68.15±8.50c芡茎多糖中剂量组 0.2 0.13±0.18c 293.48±31.20a,b 38.31±4.73b 87.02±8.75a芡茎多糖低剂量组 0.1 0.23±0.03 304.72±30.58a,c 43.40±9.01 104.64±15.65a,b

图3 可知, 与空白组比较, 模型组小鼠耳肿胀度显著（P＜0.01） 增加, 芡茎多糖各剂量组均能降低小鼠耳廓肿胀度, 其中高、 中剂量作用尤其显著（P＜0.05）。 与空白组比较, 模型组小鼠血清中TNF-α、 IL-1ß、 IL-6 的水平显著（P＜0.01） 增加。 与模型组比较, 阳性药能显著降低小鼠血清 中TNF-α、 IL-1ß、 IL-6 的 水 平 （P ＜0.01 或P ＜0.05）； 芡茎多糖各给药组中, 其中高剂量组能显著降低小鼠血清中TNF-α、 IL-1ß、 IL-6 的水平（P ＜0.01 或P ＜0.05）, 中剂量组能显著降低TNF-α、 IL-1ß 的水平（P ＜0.01）, 低剂量组仅能显著降低TNF-α 的水平（P＜0.05）。总的来说, 芡茎多糖各剂量组都能在一定程度上抑制炎症因子的表达, 具有较好的抗炎活性。

2.6 数据统计 实验结果采用SPSS 20.0 统计软件分析,用单因素方差分析组间差异的显著性, 结果采用s） 表示, P＜0.05 差异具有统计学意义。

3 讨论

本研究对芡茎多糖分离、 纯化, 并对其组成进行分析,结果表明芡茎多糖水洗脱组分EFPP1、 EFPP2 各含有4 种单糖。 另外可能还有少量未被标识的单糖。 与文献[22]报道的结果存在少量差异, 该文献中芡茎多糖共存在6 种单糖, 而本实验只检测到4 种, 可能是这2 种糖含有量太低。 二甲苯所致小鼠耳廓肿胀模型属于炎症反应早期, 主要反应炎症对毛细血管通透性改变的影响, 主要以局部血管扩张和毛细血管通透性增加为特征。 因此该模型可用于评价药物对炎症早期血管通透性增加的影响程度, 从而反映药物对急性炎症的作用。 本研究对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀实验结果表明, EFPP 各剂量组可以显著抑制由二甲苯所致小鼠耳廓肿胀, 表明EFPP 对急性炎症有一定的抑制作用。 IL-1ß 对中性粒细胞、 巨噬细胞和淋巴细胞有激活、趋化作用, 并诱导TNF-α、 IL-6 等多种细胞因子分泌引起炎症反应。 本实验中芡茎多糖能抑制二甲苯所致小鼠耳廓中IL-1ß、 TNF-α、 IL-6 的异常升高。 通过对芡茎多糖分子量、 单糖组成的测定以及抗炎活性的初步探究, 本课题组对芡茎这一废弃资源有了更近一步的认识, 以期为后续资源的开发利用提供依据。