60 Co-γ 射线辐照对黄精中微生物及多糖的影响

黄赵刚， 梁豆豆， 李飞龙， 程 钢， 葛朝亮

（1. 安徽医科大学第一附属医院药剂科， 安徽 合肥230022； 2. 安徽医科大学药学院， 安徽 合肥230022）

黄精为百合科植物滇黄精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.、 黄精Polygonatum sibiricum Red. 或多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua 的干燥根茎, 具有补气养阴、 健脾、 润肺、 益肾等功效。 现代药理研究表明[1-3], 其具有抗衰老、 调节免疫、 降血脂、 降血糖、 抗肿瘤、 改善学习记忆、 抗骨质疏松等作用, 临床主要用于内科疾病, 如痛风、高尿酸血症、 顽固性咳嗽、 糖尿病、 小儿脾疳等, 还可用于男性不育、 妇科疾病, 但其富含多糖类、 氨基酸类成分,故在贮藏过程中易发生霉变。60Co-γ 射线具有穿透力强、 灭菌效果可靠等特点, 能有效杀虫防霉, 延长花生、 人参、生姜等药材的贮藏期[4-6], 但辐照可能导致主要成分含有量变化[7-10]。 因此, 本实验考察了不同剂量60Co-γ 辐照对黄精灭菌效果及其多糖含有量的影响。

1 材料

1.1 仪器 SCJ-1311 净化工作台（苏净集团安泰公司）；SPX-150B-Z 生化培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）； 2104 电子天平（十万分之一, 上海天平仪器厂）；TU-1810 紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.2 试药 黄精购自亳州市中药饮片厂 （批号1612023521, 产地云南）, 由合肥杰能辐照科技有限公司分别经0.5、 1、 3、 6 kGy60Co-γ 射线辐照处理。 D-无水葡萄糖（110833-201506, 中国食品药品检定研究院）； 蒽酮（20170201, 上海科丰实业有限公司）； 蛋白胨（20160517-00）、 胰酪大豆胨琼脂培养基（20160111-00）、 沙氏葡萄糖琼脂培养基 （20171129-00）、 胰酪大豆胨液体培养基（20171221-00）、 麦康凯液体培养基（20171208-00）、 麦康凯琼脂培养基（20180122-00） 均购自杭州微生物试剂有限公司。 所用试剂均为分析纯； 水为灭菌注射用水。

2 方法与结果

2.1 灭菌效果评价[11]平皿法测定样品中需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数、 耐热菌数, 再以大肠埃希菌为控制菌进行控制菌检查。

2.1.1 供试品溶液制备 取供试品（未辐照及经不同剂量辐照的黄精） 25 g, 加入无菌氯化钠蛋白胨缓冲液（pH=7.0） 225 mL, 40 ～45 ℃下恒温振摇15 min, 取其清液,即得。

2.1.2 微生物计数 取供试品溶液及3 个连续10 倍稀释级（10-2、 10-3、 10-4）, 胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）浇碟法（1 mL/皿） 测定需氧菌总数； 取供试品溶液及2 个连续10 倍稀释级（10-2、 10-3）, 沙氏葡萄糖琼脂培养基（含0.1 g/1 000 mL 庆大霉素） 浇碟法（1 mL/皿） 测定霉菌与酵母菌总数； 取供试品溶液, 沸水浴30 min 后按测定需氧菌总数的方法检测耐热菌数。

2.1.3 控制菌 （大肠埃希菌） 检查 取供试品溶液10 mL, 接种至100 mL 胰酪大豆胨液体培养基中, 30 ～35 ℃下培养24 h, 取1 mL 上述培养物接种至100 mL 麦康凯液体培养基中, 42～44 ℃下培养48 h, 划线接种于麦康凯琼脂平板上, 30～35 ℃下培养72 h。 如有菌落生长, 则进行分离纯化及鉴定； 如无菌落生长, 则判断为未检出大肠埃希菌（实验中同时设置阳性对照）。

2.1.4 微生物检测 未经辐照及经不同剂量辐照的黄精在0、 1、 3、 6 个月测定需氧菌总数、 霉菌与酵母菌总数（控制菌在0 个月均未检出, 以后未继续检测； 耐热菌仅检测了0 个月）, 结果见表1。

表1 微生物检测结果

2.2 多糖含有量测定[11]

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取105 ℃下干燥至恒定质量的葡萄糖对照品33.0 mg, 置于l00 mL 量瓶中, 加水溶解并稀释至刻度, 摇匀, 即得 （每1 mL 含无水葡萄糖0.33 mg）。

2.2.2 供试品溶液制备 取不同剂量60Co-γ 辐照的黄精适量, 60 ℃下干燥至恒定质量, 打成细粉, 精密称取约0.25 g （每个样品平行2 份）, 置于250 mL 圆底烧瓶中,加80%乙醇150 mL, 水浴中加热回流1 h, 趁热过滤, 残渣用80%热乙醇洗涤3 次, 每次10 mL, 将残渣及滤纸置于烧瓶中, 加150 mL 水, 沸水浴中加热回流1 h, 趁热滤过, 残渣及烧瓶用热水洗涤4 次, 每次10 mL, 合并滤液与洗液, 放冷, 转移至250 mL 量瓶中, 加水至刻度, 摇匀, 即得。

2.2.3 线性关系考察 精密量取对照品溶液0.1、 0.2、0.3、 0.4、 0.5、 0.6 mL, 置于10 mL 具塞刻度试管中, 各加水至2.0 mL, 摇匀, 冰水浴中缓慢滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度, 混匀, 放冷后置水浴中保温10 min, 取出,立即置于冰水浴中冷却10 min, 取出。 以相应试剂为空白,紫外-可见分光光度法在582 nm 波长处测定吸光度。 以吸光度为纵坐标（A）, 质量浓度为横坐标（X） 进行回归,得方程A = 0.033 7X-0.069 0 （r = 0.999 7）, 在3.3 ～19.8 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.4 样品含有量测定 取黄精适量, 按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液, 精密量取1 mL, 置于10 mL 具塞刻度试管中, 按“2.2.3” 项下方法测定吸光度, 计算含有量, 结果见表2。

表2 多糖含有量测定结果（%， n=2）

3 讨论

60Co-γ 射线辐照具有抑制作物发芽、 保鲜、 杀虫灭菌等作用, 并且辐照灭菌法具有穿透力强、 灭菌效果好、 成本低廉、 适宜大规模生产等特点, 已收载于《中国药典》,但尚无黄精辐照的报道。 根据《60Co 辐照中药灭菌剂量标准》 （卫药发[1997] 第38 号）, 中药辐照灭菌时允许最大吸收剂量为散剂、 片剂3 kGy, 丸剂5 kGy, 中药原料粉6 kGy, 结 合 相 关 文 献, 本 实 验 选 择0.5、 1.0、 3.0、6.0 kGy。

黄精在贮藏过程中容易发生霉变, 不仅影响外观, 还可能影响有效成分含有量, 导致疗效降低, 甚至出现不良反应。 本实验通过辐照技术防止黄精霉变, 延长其贮藏期,故选择需氧菌总数, 霉菌、 酵母菌总数作为考察指标, 发现该药材经沸水浴30 min 后仍检出耐热菌, 而1.0 kGy60Co-γ 射线辐照则能有效杀灭。 此外, 还参考文献[12]选择大肠埃希菌作为控制菌, 结果未检出, 表明未受其污染。

本实验测定黄精多糖含有量时采用2015 年版《中国药典》 方法, 故未进行方法学验证。 文献[13] 报道, 辐照可引起多糖降解。 是否降解成分溶于80%热乙醇而被过滤后含有量降低, 具体原因仍不清楚, 对其药效有何影响也不明确； 唐梅、 曹夏等[14-15]研究表明, 黄精中多糖含有量随着贮存时间延长而呈下降趋势, 与本实验结果一致, 并且经60Co-γ 辐照后亦然。

4 结论

黄精经0.5～6.0 kGy60Co-γ 射线辐照处理后, 在形态、色泽、 气味上均无明显改变； 微生物数量随着辐照剂量增加显著减少, 并且在贮藏过程中微生物增长速度缓慢。 由此可知, 辐照在杀灭霉菌、 耐热菌等方面效果明显, 对黄精有明显防霉作用, 但也可能导致多糖含有量降低, 值得关注。