一测多评法同时测定梅翁退热颗粒中8 种成分

2019-08-26刘媛媛孟秀杰李丽静

中成药 2019年8期

刘媛媛，孟秀杰，李丽静

（1. 唐山职业技术学院，河北唐山063000； 2. 承德医学院附属医院药剂科，河北承德067000）

梅翁退热颗粒收载于《卫生部颁药品标准》中药成方制剂第十七册[1], 由金银花、野菊花、绵马贯众、连翘、岗梅、水翁花、鱼腥草等10 味中药材组成, 具有疏风清热、解毒利咽、消痈散结的功效, 临床上主要用于风热感冒、发热咳嗽、咽喉肿痛、胸脘胀痛、喉痹、乳蛾等疾病的治疗, 但其现行质量标准未对方中成分进行定量控制, 前期报道仅有对连翘苷含有量进行测定[2]。

中成药复方制剂中的有效成分复杂多样, 单一成分难以对其质量进行全面准确的评价和控制, 近年来多成分、多指标质量评价模式已成为相关研究的必然趋势, 但存在部分成分对照品不稳定、价格昂贵等因素, 限制了其普及和推广。一测多评法通过测定对照品易得、质量稳定的一种成分, 利用中药有效成分间存在的内在函数和比例关系建立相对校正因子, 计算其他成分含有量, 从而实现多种成分同时测定, 有效降低了检验成本。因此, 本实验采用该方法同时测定梅翁退热颗粒中木犀草苷、木犀草素、东北贯众素、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡子苷元、坡模酸的含有量, 以期为该制剂质量控制和评价提供科学依据。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）； Waters e2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）； Thermo ODS C18、 Phenomenex BDS C18、 SunFire-C18色谱柱； XPE205DR 型电子天平（十万分之一, 瑞士Mettler-Toledo 公司）； YQ-620C 型超声波清洗器（上海易净超声波仪器有限公司）。木犀草苷（111720-201609）、木犀草素（111520-201605）、连翘酯苷B （111811-201603）、连翘酯苷A （111810-201707）、连翘苷（110821-201816）对照品均购自中国食品药品检定研究院；东北贯众素（12777-70-7）、牛蒡子苷元（7770-78-7）、坡模酸（13849-91-7）对照品均购自上海纯优生物科技有限公司。梅翁退热颗粒（每袋装15 g,批号171202、 180203、 180401）购自广州康和药业有限公司。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Thermo ODS C18色谱柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；流动相乙腈（A） -0.5% 磷酸（B）, 梯度洗脱（0 ～16.0 min, 12.0% A； 16.0 ～41.0 min, 12.0% ～35.0% A； 41.0 ～49.0 min,35.0% ～52.0% A； 49.0 ～55.0 min, 52.0% ～75.0% A； 55.0 ～65.0 min, 75.0% ～12.0% A）；0～24.0 min 在350 nm[3]波长下检测木犀草苷、木犀草素, 24.0～32.0 min 在295 nm[4]波长下检测东北贯众素, 32.0～49.0 min 在275 nm[5]波长下检测连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡子苷元,49.0～65.0 min 在205 nm[6-7]波长下检测坡模酸；体积流量0.9 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 μL。

2.2 对照品溶液制备精密各对照品适量, 70%甲醇制成分别含木犀草苷0.498 mg/mL、木犀草素0.312 mg/mL、东北贯众素4.876 mg/mL、连翘酯苷B 0.574 mg/mL、连翘酯苷A 1.716 mg/mL、连翘苷0.852 mg/mL、牛蒡子苷元0.238 mg/mL、坡模酸0.702 mg/mL 的贮备液, 精密吸取适量, 70%甲醇制成每1 mL 分别含木犀草苷24.9 μg、木犀草素15.6 μg、东北贯众素243.8 μg、连翘酯苷B 28.7 μg、连翘酯苷A 85.8 μg、连翘苷42.6 μg、牛蒡子苷元11.9 μg、坡模酸35.1 μg 的溶液,即得。

2.3 供试品溶液制备取颗粒适量, 研细, 精密称取约1.0 g, 置于具塞锥形瓶中, 精密加入70%甲醇25 mL, 称定质量, 超声（300 W、 40 kHz）提取30 min, 放冷, 70% 甲醇补足减失质量, 摇匀, 滤过, 即得。

2.4 阴性样品溶液制备按照颗粒处方和制法,分别制备不含金银花和野菊花、绵马贯众、连翘、岗梅的阴性样品, 按 “2.3” 项下方法制备,即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性试验取对照品、供试品、阴性样品溶液, 在“2.1” 项色谱条件下进样测定, 结果见图1。由图可知, 各成分色谱峰分离度良好（＞1.5）, 理论塔板数均大于4 000, 阴性无干扰。

2.5.2 线性关系考察精密称取各对照品适量,置于同一20 mL 量瓶中, 70% 甲醇制成线性溶液I, 70%甲醇再依次稀释2、 4、 8、 16、 25 倍, 分别制成线性溶液Ⅱ、 Ⅲ、 Ⅳ、 Ⅴ、 Ⅵ, 精密吸取适量, 在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X）, 峰面积为纵坐标（Y）进行回归, 结果见表1, 可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5.3 精密度试验精密吸取“2.2” 项下对照品溶液, 在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次,测得木犀草苷、木犀草素、东北贯众素、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡子苷元、坡模酸峰面积 RSD 分别为 1.03%、 1.11%、 0.61%、0.94%、 0.72%、 0.85%、 1.30%、 0.89%, 表明仪器精密度良好。

2.5.4 重复性试验取同一批（批号171202）颗粒适量, 按“2.3” 项下方法平行制备6 份供试品溶液, 在“2.1” 项色谱条件下进样测定, 测得木犀草苷、木犀草素、东北贯众素、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡子苷元、坡模酸含有量RSD 分别为 0.55%、 1.63%、 1.07%、 0.18%、1.29%、 1.21%、 0.86%、 1.37%, 表明该方法重复性良好。

2.5.5 稳定性试验精密吸取同一批（批号171202）供试品溶液, 室温下于0、 2、 4、 6、 12、16 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定, 测得木犀草苷、木犀草素、东北贯众素、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡子苷元、坡模酸峰面积RSD分别为0.97%、 1.06%、 0.58%、 0.91%、 0.77%、0.82%、 1.35%、 0.94%, 表明溶液在16 h 内稳定性良好。

2.5.6 加样回收率试验精密称取含有量已知的同一批（批号171202）颗粒6 份, 每份约0.5 g, 加入对照品溶液[木犀草苷（0.267 mg/mL） 1.0 mL、木犀草素（0.199 mg/mL） 1.0 mL、东北贯众素（1.031 mg/mL） 3.0 mL、连翘酯苷B （0.363 mg/mL）1.0 mL、连翘酯苷A（1.038 mg/mL） 1.0 mL、连翘苷（0.634 mg/mL） 1.0 mL、牛蒡子苷元（0.147 mg/mL） 1.0 mL、坡模酸（0.479 mg/mL）1.0 mL], 按“2.3” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定, 计算回收率。结果, 木犀草苷、木犀草素、东北贯众素、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡子苷元、坡模酸平均加样回收率分别为 98.54%、 97.29%、100.08%、 98.88%、 99.42%、 99.04%、 96.98%、98.93%, RSD 分别为1.32%、 1.08%、 0.60%、0.94%、 1.16%、 0.79%、 1.42%、 1.22%。

2.6 相对校正因子计算精密吸取“2.5.2” 项下6 个线标溶液, 在“2.1” 项色谱条件下进样测定, 以连翘苷为内标, 计算其他7 种成分的相对校正因子fk/s, 公式为= fk/fs= （WkAs） / （WsAk）（Wk为其他成分质量浓度, Ak为其他成分峰面积,Ws为内标质量浓度, As为内标峰面积）, 结果见表2。

2.7 耐用性考察

2.7.1 仪器、色谱柱考察Agilent 1200、 Waterse2695 型色谱仪, 以及Thermo ODS C18、 Phenomenex BDS C18、 SunFire-C18色谱柱对相对校正因子的影响, 发现不同仪器、色谱柱均无明显影响,RSD 分别为 1.35%、 0.71%、 1.26%、 0.52%、1.90%、 1.17%、 0.54%。

2.7.2 体积流量考察0.8、 0.9、 1.0 mL/min 体积流量对相对校正因子的影响, 发现不同体积流量均无明显影响, RSD 分别为1.26%、 0.77%、1.18%、 0.15%、 1.83%、 1.20%、 0.44%。

表2 各成分相对校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.8 色谱峰定位以连翘苷为内标, 考察其他7种成分在不同色谱仪、色谱柱下与内标物的相对保留值, 对待测成分色谱峰进行定位, 结果见表3,可知不同仪器、色谱柱下相对保留值无明显差异。

表3 各成分相对保留值Tab.3 Relative retention values of various constituents

2.9 样品含有量测定取3 批颗粒（批号171202、 180203、 180401）适量, 在“2.1” 项色谱条件下进样测定, 分别采用外标法和一测多评法计算含有量, 结果见表4, 可知2 种方法所得结果无明显差异, 相对平均偏差（RAD）均＜2.0%。

表4 各成分含有量测定结果（mg/g）Tab.4 Results of content determination of various constituents （mg/g）

3 讨论

3.1 流动相优化本实验考察了不同流动相（乙腈-水[2-3,7-8]、乙腈-0.5%冰醋酸[3,8]、乙腈-0.5%磷酸[5-6,8-13]）对木犀草苷、木犀草素、东北贯众素、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡子苷元、坡模酸峰形、分离效果、基线平稳的影响, 同时不断优化流动相比例。最终确定, 以乙腈-0.5%磷酸为流动相, 按“2.1” 项下比例进行梯度洗脱。

3.2 供试品溶液制备方法筛选本实验考察了不同提取溶剂（甲醇[2-3,6]、 70% 甲醇[3,5]、乙醇[7]、70%乙醇[3]）对木犀草苷、木犀草素、东北贯众素、连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡子苷元、坡模酸提取率的影响, 发现以70% 甲醇为提取溶剂时, 各成分综合提取率最佳。在此基础上,又考察了不同提取方式（超声提取[3,5-8,10]、加热回流提取[2,8-9]）对各成分提取率的影响, 发现差异不大, 可能与梅翁退热颗粒生产工艺有关, 结合检验操作便捷性, 选择超声提取。同时, 又对超声提取时间（15、 30、 45 min）进行考察。最终确定, 采用70%甲醇超声提取30 min 作为供试品溶液制备方法。